无血培养的脓毒症质谱诊断制造技术

本发明专利技术涉及无血培养的脓毒症质谱诊断。具体而言，本发明专利技术涉及一种用于快速检测和快速质谱鉴定血液(脓毒症)或其它体液中感染性微生物的方法和装置。本发明专利技术认识到血液并不是微生物培养的一种良好环境，并提供一种方法，其(a)很大程度上(如可能在采样后立即)破坏和溶解体液中的人体细胞，例如血液中的红细胞和白细胞，同时必须保持微生物能够繁殖，然后(b)通过例如离心或过滤从液体中分离病原微生物，(c)在一种不含有任何体液抗微生物成分的营养肉汤中进行培养，(d)从营养肉汤中再次分离，并(e)分析微生物蛋白质质谱图与参比图谱的类似性来进行鉴定。溶解人体细胞还可释放出寄居于巨噬细胞中的微生物。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】无血培养的脓毒症质谱诊断本申请是申请日为2011年7月29日、申请号为201180038142.1、专利技术名称为“无血培养的脓毒血症质谱诊断”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及一种用于快速检测和快速质谱鉴定血液(脓毒症)或其它体液中感染性微生物的方法和装置。
技术介绍
微生物“鉴定”指的是采用分类体系进行分类:域(真核生物、原核生物和古细菌)、界(植物、动物、真菌)、门、纲、目、科、属、种和亚种。鉴定一份微生物样本指的是，至少确定到属，一般确定到种，如有可能的话，也可以确定到亚种，例如当不同亚种具有不同病原性时，这一点很重要。在更为普遍的意义上，鉴定也意味着确定微生物的其他更多的个体特性，如微生物对抗生素的抵抗性。许多种属的微生物，特别是细菌、原生动物、微藻和未分化的真菌细胞，如酵母，均可采用质谱方法进行鉴定，确定度很高，可通过将通常方式下在营养培养基上生长的克隆中的少量微生物转移至质谱样品支撑盘上，通过样本制备崩解微生物。从这一样本中获得的质谱图尤其能够显示不同的可溶性蛋白质的质量和丰度；这些蛋白质以足够高的浓度存在于微生物中。通过与参比图库中的参比图谱进行类似度分析，基于该质谱图能够鉴定该微生物。微生物鉴定对于感染性疾病而言尤为重要，特别是脓毒症。在脓毒症中，微生物从一个(通常隐蔽的)来源中持续或间断性地释放入体液中，大多数进入血液循环，以及椎管中。在脓毒症的情形下，特别重要的是，能够快速检测并鉴定病原类型从而立即给予适当的治疗。目前情况值得警惕:在德国每年有超过60，000人死于脓毒症；其已成为第三大常见死因。在美国，根据疾病预防控制中心(CDC)的估算，每年约有230，000人死于脓毒症。近年来，脓毒症病例数持续增长，每年增长约1.5%。死亡率超过40%。快速鉴定可增加生存率。在当今全球使用的传统质谱鉴定方法中，首先要培养微生物长成菌落。通常皮氏培养器皿中用于培养的营养培养基为琼脂，其可获得“单菌落”，培养时间以小时、天或周计算，这取决于微生物的活力。如果添加或混合菌落，则可通过第二次培养获得单菌落。用小拭子将所选菌落转移到质谱仪样品支持物上，并用基质(通常为α-氰基-4-羟基肉桂酸或2，5-二羟基苯甲酸)的强酸溶液喷洒，以便借由基质辅助激光解吸(MALDI)将其离子化，从而使得微生物崩解。酸(通常为甲酸或三氟乙酸)可以攻击细胞壁，并且基质溶液的有机溶剂(通常为乙腈)能够渗入微生物的细胞内并使变弱的细胞壁破裂。接下来通过蒸发溶剂干燥样品，同时会引起溶解的基质结晶。微生物中的可溶性蛋白以及细胞内的一些其它物质会在这一过程中掺入基质结晶中。掺入分析物分子的基质结晶可在质谱仪中用聚焦紫外激光脉冲轰击，生成蒸汽等离子体形式的分析物分子的离子，而这些离子可在质谱仪中根据离子质量分离进行测量。基于这一目的，通常采用飞行时间质谱。该质谱记录这些分析物离子，其主要为蛋白质离子。对于鉴定具有最有价值信息的离子的质量约为3，OOO至15，OOO原子质量单位。在本方法中，蛋白离子绝大部分是单电荷(电荷数Z = 1)，因此只需要提及离子的质量m，而不需总是使用“质量电荷比” m/z，而在使用其他类型的质谱仪时这是必须且约定俗成的)。可溶性蛋白质离子图谱，例如质谱，非常能反映所关心的微生物种属的特性，这是因为每一种微生物可产生自身的基因决定的蛋白质混合物，每种蛋白质具有特定质量。较高浓度的可溶性蛋白质的丰度可通过质谱技术检测，同样很大程度上由基因决定，仅少部分取决于营养状况或菌落成熟度。蛋白质图谱可用于微生物种属的定性，正如人类的指纹鉴定一样。目前许多公共和私人研究所正在采集可靠的参比质谱图供参比图库使用，这样就可用于医学诊断目的。不过所有的诊断方法需要根据相应国家法律由官方机构批准。在经验证的仪器上的使用经验证的图库的质谱鉴定方法已在数个州市获批。这一质谱鉴定法已被证明非常成功。其准确鉴定的可靠性远高于目前为止所用的微生物鉴定法。目前已证实，对于上百种不同种属的微生物，鉴定确定度可超过95%。存在疑虑的情况下，如果与目前微生物鉴定方法存在偏倚，则在大多数情况下基因测序可确证质谱鉴定是正确的。由于微生物种属间的关系也可通过质谱图的相似度进行鉴定，所以甚至可能在简单的质谱鉴定的帮助下校正分类体系中微生物种属的分类，最终需要通过更为复杂的DNA测序证实。为鉴定微生物，质谱将测量约2，000原子量单位至20，000原子量单位，不过在低于约3，000原子量单位的较低质量范围内的质量信号的价值较小，这是因为其可以来源于外部吸附的包被多肽以及罕见和多变的其它物质，例如膳食依赖性脂肪酸。通过仅评估约3，000-15, 000原子量范围内的质量信号可获得最佳的鉴定结果。目前基于这一目的使用的超敏感质谱仅具有低质量解析，这意味着仅相差一个原子量单位的同位素基团将无法在该质量范围内被解析。仅测量同位素基团的离子包。这种鉴定微生物的方法需要纯微生物培养物，即所谓的“分离物”，以便取得没有与其他微生物类型信号重叠的质谱。不过目前已发现，也可评估两种微生物混合物的质谱图，这样可鉴定两种微生物种属(例如，参见DE 10 2009 007 266 Al, M.Kostrzewa etal.)。鉴定可靠性仅受到轻微影响。如果该质谱图中超过2种微生物种属，或者这2个微生物种属的浓度相差很大，则会大大降低鉴定可能性和确定度。尽管脓毒症对生命产生很高风险，但是其在血液中仅有少量微生物；在脓毒症的成人患者中，每毫升血液仅有0.5-10个微生物能够繁殖。在婴儿中，这一密度会高得多，因为婴儿的免疫系统尚未完全发育。在成人中，血液中的微生物可被多种机制打败:例如被抗体识别后经由巨噬细胞，以及经由内源性抗生素，例如防御素。当血液中的防御机制未能以比感染位点释放微生物的速度快许多的速度摧毁这些微生物，则会出现脓毒症；这样会快速形成次级位点，例如在心脏瓣膜上，这通常需要立即手术。在一些清洁的体液中，例如脑脊液，一定体积内的微生物数量要比血液中高出许多，这样无需预先扩增、直接分离为质谱鉴定提供很好的机会。如想获得成功的医学治疗，则体液中存在病原至病原鉴定的时间是至关重要的。文件WPO 2009/065580 Al (U.Weller 2007)描述了一种通过离心直接从体液中分离感染性物质和质谱鉴定的方法。例如，可从沉淀(团块)直接转移微生物至质谱样品支撑盘上。不过，这种直接分离微生物的分析方法仅在体液中存在高浓度微生物的情况下可行，例如就像在肾病患者或生殖器感染患者的尿液中。如果在体液中存在人体细胞，则必须在分离微生物之前将其裂解，例如通过渗透作用；不过很长时间以来已有其它裂解方法。对于血液中的脓毒症，一种名为“裂解离心”的方法已有30年的历史；在采样后立即在皂苷(一种弱表面活性剂)的帮助下，该方法几乎可完全溶解血液颗粒，通过小心离心可分离得到微生物，在皮氏培养器皿中用适当的培养基上进行培养(不会产生血液的干扰影响)。数家公司已于十年前生产和销售添加皂苷及其它添加剂的适当制备管("Isolator?")以及相应工具，首家公司是DuPont (Wilmington, USA)，随后是WampoleLaboratories, Cranbur本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定血液中微生物的方法，包含以下步骤：a)溶解血液中的血液颗粒；b)从血液中分离微生物；c)在营养肉汤中培养微生物；d)从营养肉汤中分离微生物；e)通过对微生物蛋白质谱与参比谱图的类似性分析来鉴定微生物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M·科斯特热瓦，W·普施，T·迈尔，K·米歇尔曼，J·弗兰岑，
申请(专利权)人：布鲁克道尔顿有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE