一种大豆遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种大豆遗传转化方法。本发明专利技术提供了一种制备大豆外植体的方法，包括如下步骤：取发芽1d的大豆种子，制备大豆外植体。本发明专利技术还保护一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤：对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化。本发明专利技术通过选取不同时期的大豆子叶为外植体，缩短了转化周期，并且提高了大豆转化效率。本发明专利技术对于大豆的遗传转化具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种大豆遗传转化方法。
技术介绍
大豆(GlycinemaxL.Merr.)是重要的粮油兼用作物，也是目前转基因品种种植面积最大的作物。由于传统育种方法存在的局限性，使得转基因技术成为大豆新品种培育的重要手段。大豆目前使用较为广泛的大豆转化体系，以根癌农杆菌介导的子叶节转化体系和基因枪介导的幼胚转化体系为主。由于基因枪介导的幼胚转化受外植体取材的限制，实际应用中主要还是采用根癌农杆菌介导的子叶节转化方法。根癌农杆菌转化体系周期长(通常是用发芽5天的种子制备外植体)、转化效率低，制约着大豆分子育种的发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大豆遗传转化方法。本专利技术提供了一种制备大豆外植体的方法，包括如下步骤：取发芽1d的大豆种子，制备大豆外植体。所述制备大豆外植体的方法可为：取种子，剥去种皮，从胚轴处将子叶从中间一分为二，在子叶和胚轴连接的部位平行划伤5-7次(具体可为6次)。所述发芽1d的大豆种子的制备方法可为：将灭菌后的大豆种子接种于发芽培养基上，培养1天。所述培养的条件可为：温度为24℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述灭菌具体可为氯气灭菌。所述氯气灭菌的方法具体可为：将大豆种子平铺在培养皿中，然后将培养皿放入干燥器中，在干燥器中放入一个100ml容量的烧杯(向烧杯中先倒入80ml浓度为12M的次氯酸钠水溶液，再缓慢加入4ml浓盐酸)，然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封，放置12-16小时(具体可为14小时)。所述发芽培养基的制备方法可为：将3.1gB5盐、30g蔗糖、1mlB5有机和7.5g琼脂溶于1L水。所述大豆具体可为大豆品种Jack。本专利技术还保护以上任一所述方法制备得到的大豆外植体。本专利技术还保护以上任一所述方法制备得到的大豆外植体在大豆遗传转化中的应用。本专利技术还保护一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤：对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化。所述“对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化”的方法如下：(1)将“对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化”置于侵染菌液中，室温浸泡2小时；所述侵染菌液为重组农杆菌菌悬液；所述重组农杆菌通过将含有目的基因的重组表达载体导入出发农杆菌得到；(2)完成步骤(1)后，取外植体，采用子叶内面向上的方式在共培养培养基上培养5天；(3)完成步骤(2)后，取外植体，在恢复培养基上培养7天；(4)完成步骤(3)后，取外植体在筛选培养基上培养21天；(5)完成步骤(4)后，取外植体，切除子叶部分，将丛生芽转接到伸长培养基上，培养至丛生芽伸长3-4cm；(6)完成步骤(5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用1mg/ml吲哚丁酸水溶液浸泡茎基部，然后在生根培养基上培养至生根。所述步骤(2)具体为：完成步骤(1)后，取外植体，将子叶内面(平滑面)向上，平铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，培养5天。所述步骤(6)具体为：完成步骤(5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用1mg/ml吲哚丁酸水溶液浸泡茎基部1min，然后在生根培养基上培养至生根。所述步骤(2)中，所述培养的条件可为：温度22℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(3)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(4)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(5)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(6)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述液体培养基的制备方法可为：将0.43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、100mgL-半胱氨酸、30g蔗糖、1mlB5有机和3.9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5.4。所述共培养培养基的制备方法可为：将0.43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、100mgL-半胱氨酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机和3.9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5.4。所述恢复培养基的制备方法可为：将3.1gB5盐、0.98g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀和1mg6-BA溶于1L水；pH5.4。所述筛选培养基的制备方法可为：将3.1gB5盐、0.98g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀、1mg6-BA和8mg草丁膦溶于1L水；pH5.4。所述伸长培养基的制备方法可为：将4.0gMS盐、0.6g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀、0.1mgIAA、0.5mgGA、1mg6-BA和8mg草丁膦溶于1L水；pH5.6。所述生根培养基的制备方法可为：将2.165gMS盐、0.6g2-吗啉乙磺酸、20g蔗糖、7.5g琼脂和1mlB5有机溶于1L水；pH5.7。所述重组表达载体具体可为pTF101.1载体。所述出发农杆菌具体可为根癌农杆菌EHA101。所述侵染菌液的制备方法具体为：将所述重组表达载体导入根癌农杆菌EHA101，得到重组农杆菌；用液体培养基重悬所述重组农杆菌，得到OD600nm＝0.6的浸染菌液。液体培养基的制备方法具体可为：将0.43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、100mgL-半胱氨酸、30g蔗糖、1mlB5有机和3.9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5.4。所述大豆具体可为大豆品种Jack。因此，本专利技术通过选取不同时期的大豆子叶为外植体，缩短了转化周期，并且提高了大豆转化效率。本专利技术对于大豆的遗传转化具有重要的应用价值。附图说明图1为实施例1的步骤一的2中培养5天的种子。图2为实施例1的步骤一的3中子叶一分为二后的照片。图3为实施例1的步骤三中培养5天的外植体。图4为实施例1的步骤四中的照片。图5为实施例1的步骤五中的照片。图6为实施例1的步骤六中培养15天的照片。图7为实施例1的步骤八中的照片。图8为实施例2的步骤一的2中培养1天的种子。图9为实施例2的步骤一的3中子叶一分为二后的照片。图10为实施例2的步骤三中培养5天的外植体。图11为实施例2的步骤四中的照片。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备大豆外植体的方法，包括如下步骤：取发芽1d的大豆种子，制备大豆外植体。

【技术特征摘要】
1.一种制备大豆外植体的方法，包括如下步骤：取发芽1d的大豆种子，制备大
豆外植体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述制备大豆外植体的方法为：取种
子，剥去种皮，从胚轴处将子叶从中间一分为二，在子叶和胚轴连接的部位平行划伤
5-7次。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述发芽1d的大豆种子的制备
方法为：将灭菌后的大豆种子接种于发芽培养基上，培养1天。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述培养的条件为：温度为24℃；
每天光照16小时，黑暗8小时。
5.权利要求1至4中任一所述方法制备得到的大豆外植体。
6.权利要求5所述大豆外植体在大豆遗传转化中的应用。
7.一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤：对权利要求5所述大豆外植体进行遗
传转化。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述“对权利要求5所述大豆外植体
进行遗传转化”的方法如下：
(1)将“权利要求5所述大豆外植体”置于侵染菌液中，室温浸泡2小时；所述
侵染菌液为重组农杆菌菌悬液；所述重组农杆菌通过将含有目的基因的重组表达载体
导入出发农杆菌得到；
(2)完成步骤(1)后，取外植体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯文胜，陈莉，韩天富，姚伟伟，陶金璐，吴存祥，孙石，于洋，郭艳翠，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11