一种脂肪酶及其应用制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种脂肪酶及其应用，即从寡养单胞菌发酵粗酶液中分离纯化的脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术的脂肪酶合成的DHA甘油酯不含饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸等低效成分，合成产物中甘油酯含量高，且催化合成过程时间短，在产品品质和合成效率方面具有较明显的优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于功能酶
，具体涉及一种脂肪酶及其应用。
技术介绍
脂肪酶(LipaseE.C.3.1.1.3)是一类特殊的界面酯酶，能够水解甘油三酯的酯键产生脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯。在非水反应体系中脂肪酶还能够催化其逆反应，发生酯化反应、酯交换反应、醇解反应、酸解反应以及氨解反应等。微生物脂肪酶由于其种类多、生产周期短、便于结构修饰，且相比动植物脂肪酶具有更加广泛的温度、pH适应性，广泛的底物特异性，高度的位置选择性和异构体选择性，催化活性高，副反应少等特点使其广泛应用于食品加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学、手性药物拆分等领域。同时微生物脂肪酶催化的条件温和性和环境友好性，已经改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件，在提高生产效率的同时减少了对环境的污染，所以从自然界中筛选具有特异性活力的脂肪酶是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种脂肪酶及其应用，即从寡养单胞菌发酵粗酶液中分离纯化的脂肪酶，从而弥补现有技术的不足。本专利技术的脂肪酶，包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的多肽，2)与1)中的多肽具有85％以上序列同一性，且具有1)中酶学功能的，由1)所衍生的多肽。作为优选，所述的2)中的多肽与1)中的多肽具有90％以上序列同一性；更进一步的，具有95％以上序列同一性。本专利技术还提供编码上述脂肪酶的核酸，其一种具体的序列为SEQIDNO:2；上述的脂肪酶是从寡养单胞菌中分离纯化得到，其SDS-PAGE电泳分子量大小为22kDa。上述的脂肪酶，Fe3+和SDS能够完全抑制酶活，Cu2+，Zn2+，Al3+，Mn2+以及H2O2(1％，v/v)，Phenol(5％，w/v)能够部分抑制酶活。上述的脂肪酶，其最适的pH为7-8；在pH5-12的范围内4℃放置过夜能够保持80％以上的活力。上述的脂肪酶，其最适的反应温度为40℃；在10-40℃范围内放置1h能够维持80％以上的活力。本专利技术还提供一种重组微生物，用于重组表达上述的脂肪酶。本专利技术脂肪酶用于以甘油和DHA乙酯为底物转酯合成DHA甘油酯。相比较于现有的利用脂肪酶催化法制备DHA产品的工艺：EPA浓缩油和DHA浓缩油的制造方法(CN101765662A)、一种脂肪酶催化合成鱼油乙酯的方法(CN101979622A)、高纯度DHA藻油乙酯及其转化为甘油酯的制备方法(CN103880672A)，利用本专利技术的脂肪酶合成的DHA甘油酯不含饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸等低效成分，合成产物中甘油酯含量高，且催化合成过程时间短，在产品品质和合成效率方面具有较明显的优势。附图说明图1：本专利技术的脂肪酶纯化过程电泳图；其中泳道1为蛋白Marker，泳道2为SephadexG-75分离样品，泳道3为DEAESepharoseFastFlow分离样品，泳道4为80％硫酸铵沉淀透析液，泳道5为发酵粗酶液。图2：本专利技术的脂肪酶最适pH及pH稳定性示意图；1为最适pH示意图，2为pH稳定性示意图。图3：本专利技术的脂肪酶最适温度及温度稳定性示意；1为最适温度示意图，2为温度稳定性示意图。图4：本专利技术克隆脂肪酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；泳道1为PCR扩增产物，泳道2为DNAMarker。图5：本专利技术脂肪酶的重组表达电泳示意图；泳道1为蛋白Marker，泳道2为镍柱纯化蛋白，泳道3为重组表达粗酶液。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术的酶的分离纯化、酶学性质、克隆表达及应用进行详细的描述。实施例1：LH15脂肪酶的分离纯化本专利技术的酶是从寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)发酵粗酶液中分离纯化，该菌株是本实验从富油土壤中筛选得到的，于2015年03月30日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.10672。将寡养单胞菌种子培养液按照2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，28℃180rpm震荡培养72h，4℃8000rpm离心10min得到发酵粗酶液。种子培养基：10g/L葡萄糖，7.5g/L牛肉膏，7.5g/L蛋白胨，3g/LNaCl，1g/LMgSO4·7H2O，pH7.0，115℃蒸气灭菌20min。发酵培养基：10g/L葡萄糖，20g/L酵母粉，5g/L蛋白胨，2g/LK2HPO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，pH7.0，115℃蒸气灭菌20min。离心得到的发酵粗酶液进行80％硫酸铵沉淀。冰水浴保温，磁力搅拌的条件下均匀缓慢地向发酵粗酶液加入粉碎并干燥的硫酸铵。4℃静置过夜后离心收集沉淀，用10mMpH7.5Tris-Hclbuffer复溶沉淀，并在此缓冲液中透析。用pH8.5的10mMTris-HCl缓冲液充分平衡DEAESepharoseFF离子交换柱(10cm*1.2cm)，上样吸附。然后用pH8.5的10mMTris-HCl含有NaCl(0.1-0.6MNaCl)进行梯度洗脱，3min/管分管收集。对收集管中的溶液测酶活和蛋白质分析。将上步0.2MNaCl洗脱峰用超滤管超滤浓缩，上样1mL于以平衡好的SephadexG-75FF柱(80cm*1cm),用超纯水洗脱2.5mL/3min分管收集。对收集管中的溶液测酶活和蛋白质分析。分别测定以上几个步骤样品的酶活力和蛋白质含量并进行SDS-PAGE电泳检测。纯化结果见表1，粗酶液经过几步纯化后，比活从0.57U/mg提高到154.29U/mg，纯化倍数为270.67倍。蛋白电泳结果(图1)表明，纯化后的脂肪酶在电泳上为一条带，分子量约为22kDa。表1:脂肪酶的纯化步骤及结果实施例2：LH15脂肪酶的酶学性质(1)LH15脂肪酶分子量的测定在SDS-PAGE电泳中蛋白质的迁移率与其相对分子质量的对数成正比。因此可以通过SDS-PAGE测定目标蛋白的相对分子质量。根据SDS-PAGE中标准分子量蛋白和目标蛋白的相对迁移率计算出目的蛋白的相对分子量为22kDa。(2)LH15脂肪酶的最适pH及pH稳定性纯化后的脂肪酶在不同的pH下进行酶活测定，结果如图2所示。LH15脂肪酶pH适用范围比较窄，pH7-8为其最适反应pH，低于或者高于这个范围时，酶活减低的比较明显。pH稳定性是将酶液在不同的pH缓冲液中进行10倍稀释，4℃放置过夜，然后在标准条件下测定残余酶活。结果显示在pH5-12的范围内其能够保持80％以上的活力，具有较好的pH稳定性。(3)LH15脂肪酶最适温度及温度稳定性纯化后的脂肪酶在不同的温度(10、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪酶，包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽，2)与1)中的多肽具有85％以上序列同一性，且具有1)中酶学功能的，由1)所衍生的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶，包含有：
1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的多肽，
2)与1)中的多肽具有85％以上序列同一性，且具有1)中酶学功能的，由1)
所衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的脂肪酶，其特征在于，所述的2)中的多肽与1)中
的多肽具有90％以上序列同一性。
3.如权利要求1所述的脂肪酶，其特征在于，所述的2)中的多肽与1)中
的多肽具有95％以上序列同一性。
4.一种核酸，其特征在于，所述的核酸用于编码权利要求1所述的脂肪酶。
5.如权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述的核酸的序列为SEQID
NO:2。
6.权利要求1所述的脂肪酶，其特征在于，所述的脂肪酶是从寡养单胞菌
中分离纯化得到，其SDS-PAGE电泳分子量大...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛相朝，邱永乾，孙建安，薛长湖，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37