本发明专利技术公开了牛HIF-1A基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，并提供了具体检测方法，试剂盒包括有以下试剂：2×SYBR GREEN MIX、标准HIF-1A基因模板、超纯水和由引物一和引物二组成引物对，引物一如序列表中序列1所示，引物二如序列表中序列2所示。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的试剂盒，可以有效检测不同牛种、不同组织、不同时期的HIF-1A基因的mRNA表达状态和表达量，同时可以鉴定该基因与动物低氧适应能力的相关性，以满足生命科学、动物医学和动物科学研究者的检测需要。与现有技术相比，本发明专利技术的优点在于：1、本发明专利技术实现了方便快捷的检测HIF-1A基因转录水平的目的；2、本发明专利技术在检测基因转录水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优势。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及牛HIF-1A基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒。
技术介绍
聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是DNA体外操作技术中最常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA片段在反应液中呈2n倍扩增（其中n为热循环次数）。荧光定量PCR技术是在普通PCR反应的基础上，结合实时荧光检测技术和计算机分析技术所发展起来的基因定量方法。荧光定量PCR在普通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的量变情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值（荧光变化达到阈值时的循环数）；同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2-10个倍数稀释的已知数量的靶标DNA，获得其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。SYBRGreen是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强，这种性质使其应用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。Northernblot技术可检测基因的转录水平，但整个实验过程操作比较复杂。Northernblot实验中一个主要的问题是RNA容易降解，所以NorthernBlot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等，这使实验过程变得比较繁琐。另外，NorthernBlot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。基因芯片技术实验虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化，但是其灵敏度较低。SYBRGreen在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYBGreen的灵敏度很高。但是，由于SYRBGreen与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光值的变化可以帮助降低非特异产物对定量结果的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreen得到的定量结果。缺氧诱导因子-1也称为低氧诱导因子-1（HypoxiaInducibleFactor-1，HIF-1）普遍存在于人和哺乳动物的细胞中，常氧下虽有表达，但在缺氧条件下才可以稳定表达。HIF-1是一种异源二聚体蛋白，由α和β亚基组成，即缺氧诱导因子-1A（HypoxiaInducibleFactor-1A，HIF-1A）和缺氧诱导因子-1B（HypoxiaInducibleFactor-1B，HIF-1B）。HIF-1B亚基在细胞浆中稳定表达，而HIF-1A亚基在翻译后即被泛素-蛋白酶水解复合体降解。在正常氧饱和度下的细胞中基本检测不到亚基的表达，而在缺氧状态下，HIF-1A亚基的降解被抑制，α和β亚基形成有活性的HIF-1，转移到细胞核内调节多种基因的转录。因此，对HIF-1A基因的转录水平检测有助于鉴定动物对低氧环境的适应能力。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种操作简便、快速，且能够定量检测不同牛种（包括奶牛、黄牛和牦牛）缺氧诱导因子-1A（HypoxiaInducibleFactor-1，HIF-1A）基因转录水平的荧光定量PCR检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：用于检测牛HIF-1A基因转录水平的引物对，是由引物一和引物二组成的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如序列表中序列2所示。本专利技术的第二个目的是提供了用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，包括有以下试剂：2×SYBRGREENMIX、标准HIF-1A基因模板、上述的引物对和超纯水。进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，所述试剂盒中，2×SYBRGREENMIX、标准HIF-1A基因模板、上述的引物对和超纯水的配比为5mL：500μL：500μL：5mL。进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，所述2×SYBRGREENMIX由以下试剂组成：TaqDNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg2+5.0mmol/L、KCl100mmol/L、Tris.HCl20mmol/L、明胶0.02%、SYBRGreen染料。进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，所述标准HIF-1A基因模板如序列表中序列3所示，标准HIF-1A基因模板的浓度为0.8μmol/L。进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，上述的引物对组成的引物混合液中，引物一的浓度为8μmol/L，引物二的浓度为8μmol/L。进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，所述超纯水的纯度大于18.25MΩ.cm。本专利技术的第三个目的是提供了用于检测牛HIF-1A基因转录水平的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：1）配制荧光定量PCR反应预混液：取2×SYBRGREENMIX1000μL、上述的引物对组成的引物混合液100μL、超纯水800μL充分混匀，配制得到1900μL的荧光定量PCR反应预混液；2）将步骤1）得到的荧光定量PCR反应预混液按19μL/管分装成100小管，加至荧光定量专用PCR反应管或反应板中；3）配制10E-1、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5系列稀释度的标准HIF-1A基因模板，以及未稀释的标准HIF-1A基因模板，共6种，每种10μL，用于检测基因的扩增效率；4）荧光定量PCR反应扩增：每个装有19μL荧光定量PCR反应预混液的反应管或反应板中分别加入1μL待测cDNA、作为阴性对照的超纯水或作为阳性对照和计算扩增效率标准的HIF-1A基因模板，震荡混匀，瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪中，95℃下变性30秒，然后按95℃5秒，55.2℃20秒热循环40次，并在55.2℃时检测记录荧光信号；5）PCR反应结束后，读取各个反应的Ct值用以定量分析；同时于3%琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统下观察，灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。进一步的，上述的用于检测牛HIF-1A基因转本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测牛HIF‑1A基因转录水平的引物对，其特征在于，是由引物一和引物二组成的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如序列表中序列2所示。
【技术特征摘要】
1.用于检测牛HIF-1A基因转录水平的引物对，其特征在于，是由引物一和引物二组成的，所述引物一如序列表中序列1所示，所述引物二如序列表中序列2所示。
2.用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，包括有以下试剂：2×SYBRGREENMIX、标准HIF-1A基因模板、权利要求1所述的引物对和超纯水。
3.根据权利要求2所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，2×SYBRGREENMIX、标准HIF-1A基因模板、权利要求1所述的引物对和超纯水的配比为5mL：500μL：500μL：5mL。
4.根据权利要求3所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述2×SYBRGREENMIX由以下试剂组成：TaqDNA聚合酶0.1U/μL、dNTPs底物0.4mmol/L、Mg2+5.0mmol/L、KCl100mmol/L、Tris.HCl20mmol/L、明胶0.02%、SYBRGreen染料。
5.根据权利要求4所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述标准HIF-1A基因模板如序列表中序列3所示，标准HIF-1A基因模板的浓度为0.8μmol/L。
6.根据权利要求5所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，权利要求1所述的引物对组成的引物混合液中，引物一的浓度为8μmol/L，引物二的浓度为8μmol/L。
7.根据权利要求6所述的用于检测牛HIF-1A基因转录水平的试剂盒，其特征在于，所述超纯水的纯度大于18.25MΩ.cm。
8.用于检测牛HI...
【专利技术属性】
技术研发人员：裴杰，阎萍，郭宪，包鹏甲，褚敏，梁春年，丁学智，冯瑞林，王宏博，朱新书，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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