一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架及其制备方法，属于血管支架的技术领域。本发明专利技术包括支架本体，支架本体的外表面设有纳米涂层，纳米涂层为羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层；本发明专利技术还提供上述血管支架的制备方法，包括构建组织因子siRNA、制备携载组织因子siRNA的羟丁基壳聚糖纳米颗粒、裸金属血管支架表面碱化处理和制备羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层。本发明专利技术运用纳米技术将羟丁基壳聚糖制成纳米颗粒复合物，并将携载组织因子siRNA的羟丁基壳聚糖纳米复合物附着在血管支架上，通过释放组织因子沉默RNA基因，抑制平滑肌细胞过度增生，防止支架内血栓和再狭窄。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于血管支架的
，特别是指一种羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层血管支架及其制备方法。
技术介绍
冠状动脉支架置入术后，刺激血管平滑肌细胞（VSMC）的过度增殖和迁移，激发体内局部组织因子表达明显增高，使体内呈高血栓负荷状态，极易形成支架内血栓及支架内再狭窄。对于血管平滑肌细胞（VSMC）的过度增殖可以利用局部直接给药策略，比如药物洗脱支架（DES），来降低再狭窄的发生率。与此同时，血管内皮细胞受到不同程度的抑制，在此期间，平滑肌细胞（SMC）极易过度增殖、迁移，并释放组织因子，引起血小板聚集形成支架内血栓。最近的研究表明，药物洗脱支架（DES）的置入也可能刺激组织因子（TF）的表达，从而促进体内动脉血栓的形成。TF参与复杂的机制包括细胞内信号转导，通过调节VSMC迁移、增殖，进而引发血栓形成和血管壁重构。因此，干预血管组织因子的过度增殖是非常有意义的。基因载体的选择是基因治疗中的一个关键因素。病毒载体虽有较高的转导效率，但它存在致突变或癌变的潜能，对宿主免疫原性及生产成本高等问题，大大限制了它们的应用。脂质体具有良好的脂质生物相容性，然而，不借助于转染试剂，并不能保证高效的细胞摄取和基因沉默效应，并且阳离子脂质体具有细胞膜活性，可能对细胞产生一定的破坏作用等问题，限制了它在体内的应用。非病毒载体是目前研究的重点，壳聚糖作为药物递送载体、生物涂层和DNA和siRNA等基因转染材料的广泛研究，具有生物相容性、生物可降解、抑菌活性、药物缓释控释能力和无毒性聚合物等优点。但是，其同时也存在转染效率相对较低、水溶性差、靶向性不好的缺点。
技术实现思路
本专利技术提供一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架及其制备方法，解决了现有技术中血管支架极易形成支架内血栓、再狭窄及其涂层载体存在转染效率低、水溶性差和靶向性不好的问题。本专利技术的一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架的制备方法，其主要是通过以下技术方案加以实现的：包括以下步骤：（1）构建TF-siRNA靶序列：对TF-mRNA167-186bp序列，序列为5-GCGCTTCAGGCACTACAAAT-3，标记上荧光素，得TF-siRNA组织因子；（2）羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA纳米颗粒的制备：（a）取羟丁基壳聚糖片层状样品，用洁净的镊子撕成薄片，平铺玻璃培养皿中，置于紫外灯下正反面各照射50-80min后，溶于乙酸溶液，过滤除菌，得羟丁基壳聚糖乙酸溶液；（b）取TPP，添加水溶解，搅拌均匀，过滤除菌，得TPP水溶液；（c）取步骤（1）所得TF-siRNA组织因子添加到DEPC水中，溶解，得siRNA溶液；（d）将步骤（c）所得siRNA溶液加入到步骤（b）所得TPP水溶液中，搅拌混匀，然后，将其缓慢滴加到步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，滴加速度40-50滴/min，继续搅拌，室温孵育15-60min，分装，避光保存，得羟丁基壳聚糖纳米复合物；（3）支架表面碱化：将裸金属血管支架依次于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，并真空干燥20-40min；然后，将其置入碱性溶液中，浸泡处理，取出后用双蒸水冲洗3次以上，再放入双蒸水中超声清洗，真空干燥20-40min；（4）羟丁基壳聚糖纳米粒支架涂层的制备：将步骤（3）中所得血管支架浸入步骤（2）所得羟丁基壳聚糖纳米复合物中，调节溶液的pH值为3.4-6.4，以血管支架为阴极、铂电极为阳极、饱和甘汞电极为参比电极，于30-60℃和电流强度为0.5-2mA/cm2下，电沉积30-120min，然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并干燥，得到羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的金属支架。优选地，所述步骤（4）中，采用氢氧化钠调节羟丁基壳聚糖纳米复合物的pH值；阴极和阳极两个电极的距离为5-20mm，电位低压为-2-0V；电沉积完毕之后，在空气中采用自然晾干的方法进行干燥。优选地，所述步骤（2）中，步骤（d）所得羟丁基壳聚糖纳米溶液中，羟丁基壳聚糖的浓度为714.5ug/mL，siRNA的浓度为1.13umol/L；步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，羟丁基壳聚糖的浓度为0.5-2mg/mL，所用乙酸的浓度为0.2M，其pH值为5.5；步骤（b）所得TPP水溶液中，TPP的浓度为0.25-1.0mg/mL，采用0.22um的滤膜进行过滤除菌；步骤（c）所得siRNA溶液中，siRNA的浓度为10-30umol/L。优选地，所述步骤（3）中，超声时间为30-60min，碱性溶液的浓度为3-5M，浸泡时间为24-72h，浸泡温度为40-70℃，碱性溶液为氢氧化钠水溶液。进一步优选地，所述步骤（1）中，荧光素为FAM荧光。本专利技术的一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架，其主要是通过以下技术方案加以实现的：包括支架本体；所述支架本体的外表面设有纳米涂层，所述纳米涂层为羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层。本专利技术的有益效果是：（1）、本专利技术采用强碱处理金属血管支架，会在其表面产生微孔和-OH基团，该微孔和-OH基团能储存药物，并有利于紧密结合羟丁基壳聚糖（HBCS:TF-siRNA）纳米颗粒复合物，有利于药物缓慢释放。（2）、本专利技术中羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA可以抑制组织因子表达，同时可以干预血管平滑肌细胞增殖且能显著诱导细胞凋亡，对支架内再狭窄的起始因素实现一靶多效，即可治疗细胞增殖疾病，同时又可缓解高血栓负荷状态，为冠状动脉支架植入术后再狭窄的防治提供了新的思路和方向。（3）、本专利技术使用壳聚糖衍生物，即羟丁基壳聚糖，由于羟丁基基团的高亲水性，羟丁基壳聚糖获得一个在生理的pH范围可以完全溶解的特性，同时仍然保留其母体壳聚糖的良好的生物活性。所得羟丁基壳聚糖运载系统满足了非毒性载体的各种参数。本专利技术通过构建组织因子siRNA、制备携载组织因子siRNA的羟丁基壳聚糖纳米复合物、裸金属血管支架表面碱化处理和制备羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层而制得。该技术是纳米载药技术与基因靶向治疗在支架表面涂层材料的最新研究成果，羟丁基壳聚糖组织因子siRNA通过缓慢控制释放组织因子，具有抑制平滑肌细胞过度增生，防止支架内血栓和再狭窄。（4）、本专利技术采用TPP（三聚磷酸钠）作为离子交联，保证了一个很好的包封的效率；高分子量的壳聚糖和较高的脱乙酰度能够浓缩siRNA为分散的纳米颗粒，对复合物的稳定和促进细胞吸收是有必要的。（5）、本专利技术采用壳聚糖衍生物纳米载体运用电化学沉积技术携载组织因子siRNA制备新型涂层血管支架，该血管支架可以从基因水平抑制平滑肌细胞增生，从而根源上解决了目前支架内再狭窄的问题。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术一些实施例的部分附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建TF‑siRNA靶序列：对TF‑mRNA 167‑186bp序列，序列为5‑GCG CTT CAG GCA CTA CAA AT‑3，标记上荧光素，得TF‑siRNA组织因子；（2）羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA纳米颗粒的制备：（a）取羟丁基壳聚糖片层状样品，用洁净的镊子撕成薄片，平铺玻璃培养皿中，置于紫外灯下正反面各照射50‑80min后，溶于乙酸溶液，过滤除菌，得羟丁基壳聚糖乙酸溶液；（b）取TPP，添加水溶解，搅拌均匀，过滤除菌，得TPP水溶液；（c）取步骤（1）所得TF‑siRNA组织因子添加到DEPC水中，溶解，得siRNA溶液；（d）将步骤（c）所得siRNA溶液加入到步骤（b）所得TPP水溶液中，搅拌混匀，然后，将其缓慢滴加到步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，滴加速度40‑50滴/min，继续搅拌，室温孵育15‑60min，分装，避光保存，得羟丁基壳聚糖纳米复合物；（3）支架表面碱化：将裸金属血管支架依次于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，并真空干燥20‑40min；然后，将其置入碱性溶液中，浸泡处理，取出后用双蒸水冲洗3次以上，再放入双蒸水中超声清洗，真空干燥20‑40min；（4）羟丁基壳聚糖纳米粒支架涂层的制备：将步骤（3）中所得血管支架浸入步骤（2）所得羟丁基壳聚糖纳米复合物中，调节溶液的pH值为3.4‑5.4，以血管支架为阴极、铂电极为阳极、饱和甘汞电极为参比电极，于30‑50℃和电流强度为0.5‑1.5mA/cm2下，电沉积30‑90min，然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并干燥，得到羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的血管支架。...

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建TF-siRNA靶序列：对TF-mRNA167-186bp序列，序列为5-GCGCTTCAGGCACTACAAAT-3，标记上荧光素，得TF-siRNA组织因子；
（2）羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA纳米颗粒的制备：
（a）取羟丁基壳聚糖片层状样品，用洁净的镊子撕成薄片，平铺玻璃培养皿中，置于紫外灯下正反面各照射50-80min后，溶于乙酸溶液，过滤除菌，得羟丁基壳聚糖乙酸溶液；
（b）取TPP，添加水溶解，搅拌均匀，过滤除菌，得TPP水溶液；
（c）取步骤（1）所得TF-siRNA组织因子添加到DEPC水中，溶解，得siRNA溶液；
（d）将步骤（c）所得siRNA溶液加入到步骤（b）所得TPP水溶液中，搅拌混匀，然后，将其缓慢滴加到步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，滴加速度40-50滴/min，继续搅拌，室温孵育15-60min，分装，避光保存，得羟丁基壳聚糖纳米复合物；
（3）支架表面碱化：将裸金属血管支架依次于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，并真空干燥20-40min；然后，将其置入碱性溶液中，浸泡处理，取出后用双蒸水冲洗3次以上，再放入双蒸水中超声清洗，真空干燥20-40min；
（4）羟丁基壳聚糖纳米粒支架涂层的制备：将步骤（3）中所得血管支架浸入步骤（2）所得羟丁基壳聚糖纳米复合物中，调节溶液的pH值为3.4-5.4，以血管支架为阴极、铂电极为阳极、饱和甘汞电极为参比电极，于30-50℃和电流强度为0.5-1.5mA/cm2下，电沉积30-90min，然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并干燥，得到羟丁基壳聚糖携载组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：李健，李丹，安毅，万康，
申请(专利权)人：李健，李丹，
类型：发明
国别省市：山东;37