本发明专利技术公开了一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用。该制剂包括小分子多肽、TGF-β、地塞米松和维生素C；其中小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该制剂还可包括IGFs和BMPs中的一种或两种。将前述成分混合，即得到该制剂。该制剂能直接诱导干细胞特别是人脐带间充质干细胞向软骨分化，也能诱导人类诱导多能干细胞特别是诱导多能间充质干细胞向软骨细胞的定向诱导分化，并取得了较好的效果。因此，可将该制剂用于诱导干细胞转化为软骨细胞，进而形成软骨组织。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和医疗领域，特别涉及一种诱导干细胞向成软骨分化的制剂 及制备方法与应用。
技术介绍
干细胞（stemcell)是一类具有自我复制能力（self-renewing)的多潜能细胞。 在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞 (embryonicstemcell，ES细胞）和成体干细胞（somaticstemcell)。根据干细胞的发育 潜能分为三类：全能干细胞（totipotentstemcell，TSC)、多能干细胞（pluripotentstem cell)和单能干细胞（unipotentstemcell)(专能干细胞）。干细胞（StemCell)是一种 未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为"万 用细胞"。 胚胎干细胞具有万能分化性（pluripotency)功能，特点是可以细胞分化 (Cellulardifferentiation)成多种组织的能力，但无法独自发育成一个个体。它可以差 转成为外胚层、中胚层及内胚层三种胚层的成员，然后再差转成为人体的220多种细胞种 类。 万能分化性是胚胎干细胞与在成年人体内可找到的多功能干细胞的主要分别：多 功能干细胞只能差转成为某几种特定的细胞种类。在无外界提供差转的刺激之下（即可在 实验环境下生长），胚胎干细胞在经过多重细胞分裂之后，仍然能保有万能分化性。成人干 细胞能否保有万能分化性，直到现在仍然有争议。不过，有研究已示范了万能干细胞可以从 成纤维细胞集丛产生出来。 由于胚胎干细胞的"全能"性，仅从技术角度来说，用胚胎干细胞来培养人体组织 和器官用以治疗疾病是最理想的。但胚胎干细胞要从胚胎中提取，有关研究在一些国家遇 到伦理方面的反对，进行得不太顺利。而成年动物体内也有一些干细胞，称为成体干细胞。 它们具有一定的分化潜力，但分化方向比较固定，比如造血干细胞通常只发展成血液细胞。 成体干细胞不涉及伦理问题，研究比较便利，然而其分化能力有限。2007年11月，美国和 日本科学家分别宣布独立发现将普通皮肤细胞转化为干细胞的方法，这样得到的干细胞称 为诱导多功能干细胞（inducedpluripotentstemcellsiPS)，又名iPS细胞。iPS细胞 具有和胚胎干细胞类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障 碍，因此在医疗领域的应用前景非常广阔。随后日本科学家仅用两个移植基因培育成了人 类诱导多功能干细胞（iPS细胞），日本庆应大学教授冈野荣之的研究小组，仅用先前培育 iPS细胞所用4个诱导基因中的两个，8卩"0ct3/4"基因和"Klf4k"基因，也成功培育出了 iPS细胞。目前，国际上关于iPS细胞的研究可谓日新月异，是干细胞研究的热点领域之一。 软骨退化疾病，特别是退行性关节炎，是在中老年人群中发病率很高的一种消耗 性慢性疾病。基于种子细胞，生物材料及细胞生长因子的软骨组织工程的发展为临床修复 软骨退化和缺损提供了可能。通过软骨组织工程构建软骨的首要条件是能够获得足够量的 种子细胞。目前，用于软骨组织工程的种子细胞主要有：成体软骨细胞、成体干细胞和胚胎 干细胞。而诱导多能干细胞具有与胚胎干细胞同样的体外培养无限增值，自我更新，和多 能分化潜能的特点；同时由于诱导多能干细胞来源于成体细胞，避免了伦理道德方面问题； 而且诱导多能干细胞可以从患者的皮肤成纤维或其他种类成体细胞诱导产生，克服了软骨 组织工程中宿主对异体移植物产生免疫排斥的障碍。因此诱导多能干细胞在软骨组织工程 中细胞来源是一个长远时期的最佳选择。
技术实现思路
本专利技术的首要的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于诱导干细胞 向成软骨分化的制剂。 本专利技术的另一目的在于提供所述用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的制备方 法。 本专利技术的再一目的在于提供所述用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的应用。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制 剂，包括小分子多肽、转化生长因子-0 (TGF-0 )、地塞米松和维生素C; 所述的小分子多肽的氨基酸序列如下所示：DPKRLWCKN。 所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂，还包括胰岛素样生长因子（IGFs) 和骨形态发生蛋白（BMPs)中的一种或两种。 所述的IGFs为IGF-1和IGF-2中的一种或两种。 所述的BMPs为BMP-2、BMP-4和BMP-6中的一种以上。 所述的小分子多肽的浓度为5~50yM，优选为15~25yM，更优选为20yM。 所述的TGF-0的浓度为1~100ng/ml，优选为5~15ng/ml，更优选为10ng/ml。 所述的地塞米松的浓度为1~100yM，优选为5~15yM，更优选为10yM。 所述的维生素C的浓度为5~100mg/L，优选为40~60mg/L，更优选为50mg/L。 所述的IGFs的浓度为1~100yg/ml，优选为5~15ng/ml，更优选为10yg/ml。 所述的BMPs的浓度为1~500ng/ml，优选为90~110ng/ml，更优选为100ng/ml。 所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂，优选由如下物质组成：小分子多肽 20yM、TGF- 0 10ng/ml、地塞米松10yM和维生素C50mg/L，溶剂为培养基。 所述的培养基优选为HG-DMEM培养基。 所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的制备方法，包括如下步骤：将小分 子多肽、TGF-P、地塞米松和维生素混合后得到。 所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的制备方法，包括如下步骤：将IGFs 和BMPs中的一种或两种、小分子多肽、TGF-P、地塞米松和维生素混合后得到。 所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的应用，是将该制剂用于诱导干细胞 转化为软骨细胞，进而形成软骨组织。 所述的干细胞包括人脐带间充质干细胞和人iPS细胞。 所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的应用，包括如下步骤：用干细胞生 长培养基将干细胞培养至完全融合，接着加入用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂培养， 3~4天换液一次，诱导培养至得到软骨细胞。 所述的诱导培养的时间优选为2~3周。 本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果： (1)本专利技术提供的制剂，能直接诱导干细胞特别是人脐带间充质干细胞向软骨分 化，也能诱导人类诱导多能干细胞特别是诱导多能间充质干细胞向软骨细胞的定向诱导分 化，并取得了较好的效果 ⑵采用该制剂，诱导人脐带间充质干细胞和人iPS细胞，可以发现，细胞从加入 诱导用的组合物后，逐渐形态不规则，呈多边形、星形等，紧密排列成"铺路石"状外观，接着 细胞逐渐变为长梭形。而对照组的细胞形态不变，仍为纤维样。经甲苯胺蓝染色，细胞基质 的糖胺多糖被染上蓝色。【附图说明】 图1是软骨诱导分化对照组放大200倍的照片图；其中，图（A)为iPS-MSCs，图（B) 为hUC-MSCs。 图2是软骨诱导分化甲苯胺蓝染色放大200倍的照片图；其中，图（A)为 iPS-MSCs，图（B)为hUC-MSCs。【具体实施方式】 下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限 于此。实本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂，其特征在于：包括小分子多肽、TGF‑β、地塞米松和维生素C；所述的小分子多肽的氨基酸序列如下所示：DPKRLWCKN。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈小佳，龚国春，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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