本发明专利技术公开了一种表达小鹅瘟病毒VP2的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用，该重组鸭瘟病毒的基因组中插入有小鹅瘟病毒VP2基因，所述小鹅瘟病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述构建方法包括：(1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得pDEV-EF1；(2)将Pcmv-VP2-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-VP2；(3)将pDEV-VP2转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒。所述重组鸭瘟病毒与亲本毒株相比，其病毒蚀斑大小不具有显著差异，说明小鹅瘟病毒VP2基因的插入不影响鸭瘟病毒在鸡胚成纤维细胞上的增殖特性。所述重组鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞后成功表达小鹅瘟病毒VP2。所述重组病毒使番鸭成功免疫产生相应抗体，为鸭瘟病毒-小鹅瘟病毒二联疫苗的研制奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种表达小鹅瘟病毒VP2的重组鸭瘟病毒及 其构建方法和应用。
技术介绍
细菌人工染色体（bacteriaartificialchromosome，Bac)是高通量低拷贝的质 粒载体，最大可以容纳300kb的DNA，并能稳定传代。Bac技术为疱疹病毒反向和正向遗传 石开究提供了新方法（ShizuyaH，BirrenB，KimU，etal.Cloningandstablemaintenance of300-kilobase-pairfragmentsofhumanDNAinEscherichiacoliusingan F-factor-basedvector.Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1992, 89(18) : 8794-8797. ) 〇 目前该技术在多种疱疹病毒相继成功应用，如1型单纯疱疹病毒（StavropoulosT A,StrathdeeCA.Anenhancedpackagingsystemforhelper-dependentherpes simplexvirusvectors.JVirol, 1998, 72:7137-7143.)、人巨细胞病毒（HCMV)(Wagner M,RuzsicsZ,KoszinowskiUH.Herpesvirusgeneticshascomeofage.Trends Microbiol, 2002, 10 (7) : 318 - 324.)、牛I型疱疹病毒（张存，叶伟成，王一成，等?牛I 型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性.科学通 报，2009, 54 (24) =3823-3829.)、伪狂犬病毒（尹文玲，尹龙勃，叶伟成，等.猪伪狂犬病 毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建.病毒学报，2010, 26 (4) : 331-335.)、马立 克氏病毒（崔红玉，王云峰，石星明，等.鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构 建?生物工程学报，2008, 24(4) :569-575.)等。 鸭痕病毒DEV属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科成员，大小约160kb，含有多个可缺 失的非必需基因。目前以DEV作为载体表达外源基因已有成功的案例，LiuX等成功构建 了US2基因缺失或gl/gE双基因缺失的重组鸭瘟病毒，并以之为载体表达了鹅H5亚型禽流 感病毒的HA基因；LiuJ等研究证实在DEV疫苗株UL41基因内部插入外源基因既不影响 病毒复制表型，也不增加鸭瘟病毒疫苗株对鸭的毒力；Wang J等也成功构建了UL44(gC)基 因缺失的重组鸭瘟病毒，并以之为载体表达了H5N1禽流感病毒的HA基因。 鸭瘟病毒和鹅细小病毒（GPV)是引起番鸭和鹅发病的重要病原，给养禽业造成了 严重的危害。鹅细小病毒为细小病毒科细小病毒属成员，同义名为小鹅瘟病毒。GPV基因组 约5Kb，由左右2个完整的开放阅读框组成：L0RF(left0RF)和R0RF(right0RF)。L0RF编 码非结构蛋白NS1和NS2,R0RF编码VP1、VP2和VP3三种结构蛋白。VP2是主要免疫功能 区，可刺激机体产生中和抗体，在没有VP1的存在下，VP2可自我组装病毒样颗粒。VP2作为 GPV的表面抗原之一，已被证明有良好的抗原性，是制备GPV基因工程一面的重要候选保护 性抗原（李福伟，李惠敏，曹顶国，等.鹅细小病毒的分子生物学研究概况.水禽世 界，2007.) 〇
技术实现思路
本专利技术提供了一种小鹅瘟病毒VP2的重组鸭瘟病毒，具有制备双联疫苗的潜质。 -种重组鸭瘟病毒，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有小鹅瘟病毒VP2基因， 所述小鹅瘟病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。 优选的，所述基因组插入有Pcmv-VP2-BGH-pA表达框；其中VP2表示小鹅瘟病毒 VP2基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；所述基因组中 gfp基因的CMV启动子替换为EF1启动子。 优选的，所述小鹅瘟病毒VP2基因插入在所述基因组的US7基因和US8基因之间。 优选的，所述的重组鸭瘟病毒以鸭瘟病毒的疫苗株作为活载体。鸭瘟病毒作为病 毒活载体具有疫苗生产、储存和免疫技术成熟，且安全性良好的优势。 本专利技术还提供了一种重组鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤： (1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得PDEV-EF1 ; (2)将Pcmv-VP2-BGH-pA表达框插入pDEV-EFl，获得pDEV-VP2 ; (3)将pDEV-VP2转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒rDEV-VP2 ; 其中pDEV-vac表示携带有鸭瘟病毒疫苗株全基因组的感染性细菌人工染色体克 隆，VP2表示小鹅瘟病毒VP2基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺 苷酸尾；一般情况下P起始表示质粒，r起始表示病毒； 所述小鹅瘟病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。 所述CMV启动子替换成EF1启动子的方法为： (1)以pEP-EFl-in为模板，利用核苷酸序列如SEQIDN0. 2和SEQIDN0. 3的引 物，扩增获得目标片段；(2)将所述目标片段转入pDEV-vac/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得 pDEV-kanEFl； (3)敲除pDEV-kanEFl中的kan抗性基因，获得pDEV-EFl; 所述的pEP-EFl-in质粒图谱如图7所示；所述的 pDEV-vac/GS1783为携带 pDEV-vac的大肠杆菌 GS1783。 所述Pcmv-VP2-BGH-pA表达框插入pDEV-EFl的方法为： (1)人工合成所述小鹅瘟病毒VP2基因，插入pEP-BGH-end，获得pEP-BGH-VP2 ; (2)以pEP-BGH-VP2为模板，利用核苷酸序列如SEQIDN0. 4和SEQIDN0. 5的引 物，扩增获得目标片段； (3)将所述目标片段转入pDEV-EFl/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得 pDEV-kanVP2； (4)敲除pDEV-kanVP2 中的kan抗性基因，获得pDEV-VP2 ; 所述的pEP-BGH-end质粒图谱如图8所示。 本专利技术在鸭瘟病毒疫苗株的基础上，结合RedE/T重组技术将pDEV-vac上gfp基 因的CMV启动子替换为EF1启动子，以便于小鹅瘟病毒VP2基因准确插入到pDEV-EFl的预 期位置，同时有利于启动小鹅瘟病毒VP2基因的表达。该技术不需要特定的限制性酶切位 点，只需较短的同源序列，即可在生物体内完成重组过程，省去了体外DNA酶切、连接等步 骤。 本专利技术又提供了所述的重组鸭瘟病毒在制备动物疫苗中的应用。 本专利技术得到的重组鸭瘟病毒与亲本毒株相比，其病毒蚀斑大小不具有显著差异， 说明小鹅瘟病毒VP2基因的插入不影响鸭瘟病毒在鸡胚成纤维细胞上的增殖特性。 本专利技术得到的重组鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞后成功表达小鹅瘟病毒VP2,且 该重组鸭瘟病毒感染番鸭后成功诱发机体产生针对VP2蛋白的抗体，为鸭瘟病毒-小鹅瘟 病毒二联疫苗的研制奠定了基础。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有小鹅瘟病毒VP2基因，所述小鹅瘟病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈柳，张存，倪征，叶伟成，余斌，云涛，华炯钢，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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