本发明专利技术公开了强冬性白菜型冬油菜SOD酶分子标记及QTL位点，其筛选步骤包括：（1）利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜‘陇油7号’和强抗寒冬油菜‘陇油9号’杂交构建F2代分离群体；（2）采用CTAB法提取两亲本及F2代分离群体的叶片DNA；（3）利用SSR和InDel引物对两亲本DNA进行多态性引物筛选；（4）通过F2分离群体获得基因型数据构建遗传连锁图和QTL分析；（5）获得了2个强冬性白菜型冬油菜SOD酶的QTL位点，分别命名为Qsod.gsau-6A和Qsod.gsau-7A；与2个强冬性白菜型冬油菜SOD酶的QTL位点连锁的4个分子标记分别为：Ra1-F06、Ra2-D04、8C0108和Ol12E03。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学及遗传育种
，更具体涉及强冬性白菜型冬油菜 S0D酶活性基因QTL位点，同时还涉及与强冬性白菜型冬油菜S0D酶活性基因QTL位点连锁 的分子标记。
技术介绍
白菜型油菜在我国栽培历史悠久，种质资源丰富，是我国重要的油料作物之一。但 白菜型油菜以春性为主，强冬性白菜型冬油菜种质缺乏，适宜北方旱寒区种植的强冬性冬 油菜品种尤其缺乏。我国北方气候严寒，冬油菜具备优异抗寒性才能安全越冬，因此抗寒品 种选育是北方冬油菜发展的关键。采用常规育种方法选育抗寒材料费时费力，且选择效率 较低，如果借助分子标记辅助育种，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高 选择效率。 S0D是植物重要的保护性酶之一，在抵御外界低温环境中起着积极作用。因此S0D 酶活性的高低是衡量植物抗寒性强弱的指标之一。关于SOD酶活性及其基因的研究很多， 研究认为其符合数量性状的遗传特点。但不同作物中，其基因序列，表达模式、遗传效益有 所不同。近年强冬性白菜型冬油菜中S0D酶活性的研究甚多，但对其分子标记及QTL定位的 研究尚未见报道。本研究通过QTL定位，旨在筛选出S0D的QTL位点和分子标记，用于S0D 基因的克隆和强冬性白菜型冬油菜抗寒育种的分子标记辅助选择。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中的缺点而提供了 2个强冬性白菜 型冬油菜S0D酶活性的QTL位点，该2个位点的效应值都比较高，对白菜型冬油菜S0D酶活 性调控起着重要作用，可用作定位克隆和分子标记辅助选择。 本专利技术还提供4个与强冬性白菜型冬油菜油S0D酶活性的QTL位点紧密连锁的分 子标记，这些标记与QTL位点的遗传距离较近且是基于PCR技术的SSR和InDel标记，因 而可靠且使用方便，这对强冬性白菜型冬油菜抗寒育种提供便利。 为解决本专利技术的技术问题采用如下技术方案： 强冬性白菜型冬油菜S0D酶分子标记及QTL位点，其筛选包括有以下步骤： (1)构建分离群体：利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜'陇油7号'和强 抗寒冬油菜'陇油9号'配置杂交组合，杂交F1代自交产生F2代分离群体。本专利技术用到 的实验材料由甘肃农业大学油菜遗传育种课题组提供。 (2)油菜叶片DNA提取：采用CTAB法提取亲本'陇油7号'和'陇油9号'及F2 代分离群体的叶片DNA。 (3)引物来源及合成：由上海生物工程技术有限公司合成315对引物，引物来源 于www.UK crop, net发表的油菜微卫星引物序列以及Brassica Database网站http:// brassicadb. org/上公布的10个染色体上的所有引物，其中SSR引物51对，InDel引物264 对。 (4)多态性引物筛选：利用合成的引物对两亲本DNA进行PCR扩增，筛选出具有多 态性的引物。该过程涉及PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染、照相等步骤。 (5)多态性引物在F2代检测：将筛选出的多态性引物在F2代中进行检测，获得基 因型数据，该过程与（4 )步骤基本相同。 (6)遗传连锁图构建及QTL定位：根据F2代基因型数据，利用QTL IciMapping V3. 3软件进行遗传连锁图构建及QTL定位。 通过筛选步骤获得强冬性白菜型冬油菜S0D酶的2个QTL位点，分别命名为： Qsod. gsau-6A和Qsod. gsau-7A，与2个强冬性白菜型冬油菜S0D酶的QTL位点连锁的4个 分子标记分别为：Ral-F06、Ra2-D04、8C0108、0112E03,4个标记的序列分别如下： Ral-F06-F ：ACCAAAATGTGTGAAGCCAC Ral-F06-R ：CTTGTGGCCAGATTCATCAC Ra2-D04-F ：TGGATTCTCTTTACACACGCC Ra2-D04-R ：CAAACCAAAATGTGTGAAGCC 8C0108-F ：GAATATTCGTACACAGAGGAG 8C0108-R ：CCACACCAAGGGGCGTAGA 0112E03-F ：CCTACACTTGCGGTCTTCACC 0112E03-R ：GGTTAACCTGCGGGATATTG〇 Qsod. gsau_6A位点位于6A染色体上，与标记Ral_F06和Ra2_D04连锁，可解释 81. 1753%的表型变异，加性效应为0. 1005,显性效应-7. 2815。 Qsod. gsau-7A位于7A染色体上，与标记8C0108和0112E03连锁，可解释63. 9436% 的表型变异，加性效应为0. 1102,显性效应-6. 7267。 本专利技术的有益效果：本专利技术首次定位得到2个强冬性白菜型冬油菜S0D酶活性 QTL位点，并给出与2个强冬性白菜型冬油菜S0D酶活性QTL位点连锁的分子标记，分别解 释81. 1753%和63. 9436%的表型变异。在常规抗寒育种中，试验材料需通过越冬来判断其 抗寒性的强弱，费时费力。通过检测S0D酶活性QTL位点，在苗期就可以筛选材料，大大提 高了筛选效率，节约生产成本，加快育种进程。同时S0D酶活性QTL位点的获得，可进一步 进行S0D酶基因的克隆，为强冬性白菜型冬油菜抗寒机理的探索提供技术支撑。【附图说明】 图1为本专利技术强冬性超强抗寒冬油菜'陇油7号'和强抗寒冬油菜'陇油9号'杂 交F2代群体S0D酶活性分布图； 图2为本专利技术利用两亲本筛选多态性引物； 图3为本专利技术多态性引物BrID10873在F2代中的检测结果； 图4为本专利技术Qsod. gsau-6A位点在2A染色体的位置及L0D曲线示意图； 图5为本专利技术Qsod. gsau-7A位点在7A染色体的位置及L0D曲线示意图。【具体实施方式】 以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限 定本专利技术的范围。 实施例1 :强冬性白菜型冬油菜分离群体的构建及S0D酶活性测定。 本实施例中使用的分离群体具体构建如下： (1)2010年8月利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜'陇油7号'和强抗 寒冬油菜'陇油9号'配置杂交组合，2011年5月收获F1代种子。 (2)2011年8月播种F1种子，2012年4月套袋自交，获得F2代种子。 2012年8月播种F2代种子。待苗期随机选取103株挂牌标记，于11月初采集新 鲜幼叶，用冰盒带回实验室并保存于_70°C超低温冰箱。采用氮蓝四唑（NBT )光还原法 测定S0D酶活性。结果表明：F2代S0D酶活性均呈连续分布，但变异分布不呈典型正态分 布，证明S0D酶性状属于数量性状且存在主效基因位点（图1)。 实施例2 :亲本和F2代分离群体叶片总DNA的提取。 采用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下： (1)采摘健康幼叶作为提取油菜基因组DNA的材料，用蒸馏水洗净，用纸吸干。 (2)取新鲜的叶片0. 5g左右置于研钵中，加入液氮，迅速研磨至发白粉末状后立 即装入2ml离心管。 (3)加入已预热的2XCTAB提取缓冲液700ul浸透粉末并倒转离心管，使粉末充分 散开，于65°C水浴60min，其间轻柔混合2-3次。 (4)取出离心管，冷却至室温，加入700ul的氯仿/异戊醇（24/1)，轻本文档来自技高网...
【技术保护点】
强冬性白菜型冬油菜SOD酶分子标记及QTL位点，其特征在于：通过筛选步骤获得强冬性白菜型冬油菜SOD酶的2个QTL位点，分别命名为：Qsod.gsau‑6A和Qsod.gsau‑7A，与2个强冬性白菜型冬油菜SOD酶的QTL位点连锁的4个分子标记分别为：Ra1‑F06、Ra2‑D04、8C0108、Ol12E03。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙万仓，杨刚，曾秀存，刘自刚，武军艳，方彦，李学才，孔德晶，赵艳宁，米超，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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