一种细胞热证模型的建立方法技术

本发明专利技术涉及一种细胞热证模型的建立方法；本发明专利技术是体外培养肝原代细胞，加入附子含药血清，通过检测对细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、T-ATP酶活力，线粒体膜电位，细胞内游离钙离子浓度，ATP含量、细胞能荷等各指标，分析附子含药血清组与正常胎牛血清培养组在肝细胞能量代谢方面的不同影响，从而建立细胞热证模型。具体细胞热证模型的建立方法如下：一、原代肝细胞培养；二、ATP酶活力检测；三、ATP含量及其能荷测定；四、游离钙浓度检测；五、细胞膜电位检测。本发明专利技术可以为体外进行寒热药性对能量代谢的影响搭建了细胞平台，为研究寒热药性对能量代谢的影响提供了良好的细胞模型，以利于体外高通量进行寒热药的能量代谢研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞药理实验
，特别涉及。
技术介绍
四性是指药物有寒热温凉四种不同的药性，又称四气。它是中药药性理论的重要 组成部分，也是中药区别于植物药、天然药的重要标志。因此，用现代科学知识探讨和阐明 药性的本质及药性的发生机制是极为必要的。从上个世纪中叶以来，国内外学者从临床研 究、实验研究、文献研究及中药物质基础研究等方面进行了广泛而深入的研究，主要集中在 中药四性及其所针对的寒热病症在药物、机体间能量代谢关系、药物整体功效特征、药物对 神经系统功能影响、药物基础物质成分、药物对机体内分泌系统功能影响、药物主要活性成 分分子量等方面。实践证明，对中药寒热药性属性的规律性认识主要来自于药物作用于人 体所产生的反应和所获得的疗效的总结。决定一种中药是寒性还是热性不仅在于哪一种或 哪几种物质成分种类、数量的多少，还决定于中药固有物质在体内对相应寒证和热证能不 能起到调节作用、起到什么程度的调节作用。以往有关能量代谢的研究主要集中在动物体 内实验来。涉及到寒热药性中药对体温、耗氧量、超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶等基础指 标，以及从摄入能、消化能、可代谢能等方面探讨寒热药性的影响。为了在细胞水平进行药 性的寒热研究，我们运用热性药附子含药血清建立细胞热证模型，拟从细胞水平探索符合 中药四性研究的方法与手段，阐示寒热药性的本质及性效发生规律，为更好的指导临床用 药奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立热证细胞模型，为从细胞水平进行不同寒热药性对能量代谢 的影响提供可靠模型，并可进一步拓展应用于药性其他方面的研究。本专利技术是体外培养肝 原代细胞，加入附子含药血清，通过检测对细胞Na+- K+-ATP酶、Ca2+_ Mg2+-ATP酶、T-ATP 酶活力，线粒体膜电位，细胞内游离钙离子浓度，ATP含量、细胞能荷等各指标，分析附子含 药血清组与正常胎牛血清培养组在肝细胞能量代谢方面的不同影响，从而建立细胞热证模 型。具体细胞热证模型的建立方法如下： ： 一、原代肝细胞培养：用75%的酒精擦拭乳鼠，带入超净工作台，冰盘下断头取肝脏，手 术刀削除包膜和结缔组织等。PBS (用量：l-2ml)清洗两三次，剪切肝脏成lmm3大小的组 织块，再用PBS吹打清洗两三次，待组织块沉淀后弃上清液。吸取0. 20%的胶原酶2ml (以 浸过组织块为适宜)，放入4°C冰箱静置消化过夜。吸取2ml完全培养液用以终止胶原酶消 化，将消化完全的组织块用吸管吹打，吹打过程中力度均匀，尽量不要出现气泡以及尽量避 免组织粘附在吸管壁上。吹打后的悬液用200目尼龙网过滤到小烧杯，得到的滤液再次用 吸管吹打，吹打后的悬液加入少量完全培养液，4°C冰箱静置20min，在静置过程中血细胞以 及细胞碎片大多都悬浮于悬液中，而肝细胞则会沉淀于底部，弃悬液。加入完全培养液lml， 吹打起沉淀的细胞，lOOOr/min离心5min，弃上清液。重复操作离心三次，纯化肝细胞。最 后一次离心后加入完全培养液吹细胞，将吹打均匀的细胞悬液等量的转移到培养瓶中，置 于二氧化碳培养箱中培养。10小时后首次换液，换液时应该缓慢的吸取出上次的培养液，然 后贴培养瓶底部添加入新的培养液4ml。以后每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化，并且 拍照，每隔两天换一次培养液，换液量为4ml。 二、ATP酶活力检测：原代培养的肝细胞在6-10小时之内对培养的细胞进行第一 次换液，换液标准为：全量换液，换液量为每孔50〇μ1 ;经过24小时培养后第二次换液时进 行药物干预细胞培养。所用培养液分别为20%附子含药血清培养液，20%胎牛血清培养液， 换液量为50〇μ1，并且做三组平行实验培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含 药血清的培养液。此时所得的细胞即为ATP酶活力检测的实验细胞。将培养板上的贴壁肝 细胞用细胞刮沿壁轻轻地刮下来，收集好每个培养孔里的悬液，然后在倒置显微镜下采用 血球计数板和细胞计数器进行细胞计数。将收集好各组细胞储备于塑料离心管里，然后置 于超声波细胞粉碎机进行超声波细胞破碎。破碎后的细胞即可用于试剂盒检测。附子含药 血清组与胎牛血清组组相比，原代肝细胞Na + - K + - ATP酶活力显著升高，差异具有显 著性（Ρ〈0· 05)。 附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞Ca2 + - Mg2 + - ATP酶活力显 著升高，差异具有显著性（P〈〇. 05)。附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞T-ATP 酶活力显著升高，差异具有显著性（P〈〇. 05)。 三、ATP含量及其能荷测定：将附子含药血清干预培养后的原代肝细胞用细胞刮 从培养板中收集后细胞计数不少于IX 106,1000r/min离心5min，制成混悬液，然后分别加 入蛋白沉淀剂沉淀蛋白，再次4000 r/min离心20min，吸取上清液，4°C储存备用，进样前 用0. 45Mm微孔滤膜过滤。精密称取对照品ATP、ADP、AMP适量，加甲醇分别溶解至浓度为 0.05mg/ml、0.03mg/ml、0.06mg/ml，4 °C储存备用。色谱条件为：流动相：乙腈（A)_50mmol/ L磷酸钠（磷酸调PH=7)、10mmol/L四丁基溴化铵（B)，其中VA:VB=5:95 ;流速：LOml/min ; 检测波长：254nm ;柱温：30°C;ATP及能荷计算方法为：ATP含量（μ g/g)=样品峰面积X对 照品的浓度/ (对照品峰面积X样品浓度);ADP含量（μ g/g)=样品峰面积X对照品的浓 度/ (对照品峰面积X样品浓度）；AMP含量（μ g/g)=样品峰面积X对照品的浓度/ (对 照品峰面积X样品浓度）；能荷=(ATP+0. 5XADPV(ATP+ADP+AMP)。附子含药血清组与胎 牛血清组相比，原代肝细胞的ATP含量显著升高，差异具有显著性（P〈0. 05);原代肝细胞的 能荷显著升高，差异具有显著性（P〈〇. 05)。 四、游离钙浓度检测：原代细胞培养，将消化后的肝细胞悬液均匀的分配到六孔板中， 置于二氧化碳培养箱中培养；在6-10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液标准 为：全量换液，换液量为每孔50〇μ1 ;经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预细胞 培养。所用培养液分别为20%附子含药血清培养液，20%胎牛血清培养液，换液量为50〇μ1， 并且做三组平行实验；培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含药血清的培养 液；然后每孔中滴加20〇μ1 Fluo-3/AM工作液进行细胞染色；将培养板置于37°C的二氧化 碳培养箱中避光孵育30分钟； 去除Fluo-3/AM工作液，用PBS冲洗2次，加入20〇μ1培养液，将培养板用锡纸包裹避 光，室温放置30min。用激光共聚焦显微镜分别在10倍、20倍视野里观察染色细胞的形态， 并且做好实验数据的记录。附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞内游离钙浓度 显著升高，差异具有显著性，且具有统计学意义（P〈〇. 05)。 五、细胞膜电位检测：原代细胞培养，将消化后的肝细胞悬液均匀的分配到六孔板 中，置于二氧化碳培养箱中培养；在6-10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液标 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞热证模型的建立方法；其特征在于：一、原代肝细胞培养：用75%的酒精擦拭乳鼠，带入超净工作台，冰盘下断头取肝脏，手术刀削除包膜和结缔组织等，PBS（用量：1‑2ml）清洗两三次，剪切肝脏成1mm3大小的组织块，再用PBS吹打清洗两三次，待组织块沉淀后弃上清液，吸取0.20%的胶原酶2ml（以浸过组织块为适宜），放入4℃冰箱静置消化过夜，吸取2ml完全培养液用以终止胶原酶消化，将消化完全的组织块用吸管吹打，吹打过程中力度均匀，尽量不要出现气泡以及尽量避免组织粘附在吸管壁上，吹打后的悬液用200目尼龙网过滤到小烧杯，得到的滤液再次用吸管吹打，吹打后的悬液加入少量完全培养液，4℃冰箱静置20min，在静置过程中血细胞以及细胞碎片大多都悬浮于悬液中，而肝细胞则会沉淀于底部，弃悬液，加入完全培养液1ml，吹打起沉淀的细胞，1000r/min 离心5min，弃上清液，重复操作离心三次，纯化肝细胞，最后一次离心后加入完全培养液吹细胞，将吹打均匀的细胞悬液等量的转移到培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养，10小时后首次换液，换液时应该缓慢的吸取出上次的培养液，然后贴培养瓶底部添加入新的培养液4ml，以后每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化，并且拍照，每隔两天换一次培养液，换液量为4ml；    二、ATP酶活力检测：原代培养的肝细胞在6‑10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液标准为：全量换液，换液量为每孔500µl；经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预细胞培养，所用培养液分别为20%附子含药血清培养液，20%胎牛血清培养液，换液量为500µl，并且做三组平行实验培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2‑3次去除含有含药血清的培养液，此时所得的细胞即为ATP酶活力检测的实验细胞，将培养板上的贴壁肝细胞用细胞刮沿壁轻轻地刮下来，收集好每个培养孔里的悬液，然后在倒置显微镜下采用血球计数板和细胞计数器进行细胞计数，将收集好各组细胞储备于塑料离心管里，然后置于超声波细胞粉碎机进行超声波细胞破碎，破碎后的细胞即可用于试剂盒检测，附子含药血清组与胎牛血清组组相比，原代肝细胞Na＋‑ K＋‑ ATP酶活力显著升高，差异具有显著性（P<0.05），附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞Ca2＋‑ Mg2＋‑ ATP酶活力显著升高，差异具有显著性（P<0.05）；附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞T‑ATP酶活力显著升高，差异具有显著性（P<0.05）；    三、ATP含量及其能荷测定：将附子含药血清干预培养后的原代肝细胞用细胞刮从培养板中收集后细胞计数不少于1×106，1000r/min离心5min，制成混悬液，然后分别加入蛋白沉淀剂沉淀蛋白，再次4000 r/min 离心20min，吸取上清液，4℃储存备用，进样前用0.45µm 微孔滤膜过滤，精密称取对照品ATP、ADP、AMP适量，加甲醇分别溶解至浓度为0.05mg/ml、0.03mg/ml、0.06mg/ml，4 ℃储存备用，色谱条件为：流动相：乙腈（A）‑50mmol/L磷酸钠（磷酸调PH=7）、10mmol/L四丁基溴化铵（B），其中VA:VB=5:95；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；ATP及能荷计算方法为：ATP含量（μg/g）=样品峰面积×对照品的浓度/（对照品峰面积×样品浓度）；ADP含量（μg/g）=样品峰面积×对照品的浓度/（对照品峰面积×样品浓度）；AMP含量（μg/g）=样品峰面积×对照品的浓度/（对照品峰面积×样品浓度）；能荷=(ATP+0.5×ADP)/(ATP+ADP+AMP)，附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞的ATP含量显著升高，差异具有显著性（P<0.05）；原代肝细胞的能荷显著升高，差异具有显著性（P<0.05），  四、游离钙浓度检测：原代细胞培养，将消化后的肝细胞悬液均匀的分配到六孔板中，置于二氧化碳培养箱中培养；在6‑10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液标准为:全量换液，换液量为每孔500µl；经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预细胞培养，所用培养液分别为20%附子含药血清培养液，20%胎牛血清培养液，换液量为500µl，并且做三组平行实验；培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2‑3次去除含有含药血清的培养液；然后每孔中滴加200µl Fluo‑3/AM工作液进行细胞染色；将培养板置于37℃的二氧化碳培养箱中避光孵育30分钟；去除Fluo‑3/AM工作液，用PBS冲洗2次，加入200µl培养液，将培养板用锡纸包裹避光，室温放置30min，用激光共聚焦显微镜分别在10倍、20倍视野里观察染色细胞的形态，并且做好实验数据的记录，附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王世军，季旭明，赵海军，韩冰冰，王媛，
申请(专利权)人：王世军，
类型：发明
国别省市：山东;37