一种荧光探针法常温等温核酸扩增法制造技术

本发明专利技术涉及一种荧光探针法常温等温核酸扩增法，包括恒温条件下，单链结合蛋白将双链的母链局部打开成单链；重组酶与引物结合成复合体，在辅助蛋白的作用下结合到母链上，荧光探针也与互补区域结合；DNA聚合酶结合到引物的3’末端，进行子链的延生；核酸外切酶识别双链状态下的荧光探针上的四氢呋喃位点，酶切后使荧光基团和淬灭基团得以分离，释放荧光；荧光探针被切断后，露出了原本被探针3'末端修饰所封闭掉的3'-OH端，DNA聚合酶可以继续延伸形成子链；通过检测扩增曲线的形状，和荧光信号的强弱，可对待测样本进行定性且半定量检测。本发明专利技术的核酸扩增法可在常温且恒温检测，并能够对核酸待测物进行定性且半定量测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及，是在常 温条件下，对核酸目标物进行快速、实时及准确的检测，可应用于生物检测相关的诸多领 域，例如临床医学、疾病预防与控制、或食品安全等。
技术介绍
在医学，特别是疾病预防与控制领域，传统核酸体外扩增技术，聚合酶链式反应 (PCR)对致病病原体（含细菌、病毒与寄生虫）的快速分子检测，也是在经历了一个漫长且 不断技术革新的过程后，才在医学分子诊断领域获得高度的认可。初期的扩增后琼脂糖凝 胶电泳检测方式，因开放式检测，易造成气溶胶污染，致使假阳性频繁出现，继而即被荧光 染料检测方式所取代。虽然通过DNA双链结合染料，例如SYBRGreen，的使用，实现了扩增 体系的一管式密闭检测，从而大大降低了假阳性产生的机率。然而因引物二聚体的影响，检 测的特异性仍受到质疑。鉴于此，向反应体系中引入一条寡核苷酸链，即带双标记（荧光 基团与淬灭基团）的荧光探针，从而能与一对引物共同特异性检出核酸目标物。因此，荧 光探针法（荧光PCR)因其检测的高特异性与灵敏性等优点，逐步取代了染料法，得以广泛 应用于临床分子诊断检测领域。鉴于待检核酸目标物序列的不同，可选荧光探针亦有所不 同：TaqMan双标记水解探针、分子信标探针（茎环结构）、以及新型的TaqMan-MGB，其中以 TaqMan探针应用最多，也最广。虽然当前荧光PCR已应用到诸多领域，但是对精密检测仪器 (PCR仪）的依赖，使其使用场所多局限于中心实验室，如需在资源匮乏的地区，且不便长期 长途运送检测样本的情况下，进行样品的现场检测时，荧光PCR就难以满足需求了。 近十年来新兴的核酸等温扩增
，不但为体外核酸扩增提供了更多的选 择，而且使现场快速进行核酸检测逐渐成为可能。由于工作原理的不同，一部分核酸等温扩 增技术不在反应体系中直接使用探针，例如环介导等温扩增技术（LAMP)、单引物等温扩增 技术（SPIA);另一部分则基于不同原理，利用探针实现核酸的快速检测：1)依赖于核酸序 列的扩增（NASBA)，利用两个特殊设计的引物、分子信标探针与三种酶可在恒温（41度）条 件下，1.5-2小时内完成RNA核酸目标物的检测；2)滚环扩增技术（RCA)，利用二条或多条 引物、锁式探针与DNA连接酶和聚合酶（具有链置换活性），通过变性模板获得环化单链、探 针模板杂交及连接等步骤后，再在60或30度进行10分钟或过夜温育，后进行产物检测；3) 依赖解旋酶的等温扩增技术（HDA)，利用一对引物、TaqMan双标记水解探针、解旋酶、DNA单 链结合蛋白与DNA聚合酶，可在37度或65度于30分钟到2小时内完成核酸的实时检测； 4)链替代扩增技术（SDA)，利用两对引物、发卡茎环结构探针（双标记）、限制性内切核酸酶 与DNA聚合酶（具有链置换活性），通过"95度变性、37度复性、37度温育60分钟、最后95 度终止反应"一系列过程，完成核酸产物的检测；5)切刻内切酶核酸恒温扩增技术（NEM)， 利用一对引物（其中一条引物5'端标记Biotin)、一条探针（3'端标记FITC)、聚合酶与切 刻内切酶，再结合改造后的免疫层析显色法，共同在54度温育30分钟至1小时，最后95度 变性后完成检测。 因此，需要专利技术一种扩增技术以克服核酸等温扩增技术和荧光PCR的各种缺陷， 减少荧光PCR对精密仪器的依赖。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，克服目前荧光PCR对 精密仪器的依赖较大，且核酸等温扩增技术还无法实现完全等温且PCR产物定量不够精确 的问题。 本专利技术通过以下技术方案来实现：，该方法 包括以下步骤： (1)恒温条件下，单链结合蛋白将双链的母链局部打开成单链； (2)重组酶与引物结合成复合体，在辅助蛋白的作用下结合到母链上，荧光探针也 与互补区域结合，所述的荧光探针中部标记有四氢呋喃，四氢呋喃两侧分别为荧光基团和 淬灭基团，荧光基团和淬灭基团之间间距为2-6nt，荧光探针3'末端标记阻抑聚合酶延伸 或扩增的修饰基团； (3)DNA聚合酶结合到引物的3'末端，进行子链的延生； (4)核酸外切酶识别双链状态下的荧光探针上的四氢呋喃位点，酶切后使荧光基 团和淬灭基团得以分离，释放荧光； (5)荧光探针被切断后，露出了原本被探针3'末端修饰所封闭掉的3'-OH端，DNA 聚合酶可以继续延伸形成子链； (6)通过检测扩增曲线的形状，和荧光信号的强弱，可对待测样本进行定性且半定 量检测。 进一步的，所述的荧光探针长度为46_52nt。 进一步的，所述的荧光探针3'末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团为 C3-spacer、磷酸基团、生物素、生物素-TEG或胺基中任意一种。 进一步的，所述的荧光基团为 FAM、HEX、VIC、JOE、Texas Red、Cy3、Cy5 或 TAMRA 中 的任意一种。 进一步的，所述的淬灭基团为BHQl或BHQ2。 进一步的，所述的重组酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，辅助蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID No. 2所示，单链结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，DNA聚合酶的氨 基酸序列如SEQ ID No. 4所示，核酸外切酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。 进一步的，所述的恒温条件为25-42度。 更详细的，本专利技术中： 一对引物，是两条寡核苷酸单链，特异性结合与目标区域的上下游，1)类似PCR - 对引物，但是长度更长，30-35核苷酸（nt) ;2)序列选择时需注意避免：非特异性结合位点、 多个重复序列、回文序列、形成内部二级结构、形成引物间二聚体；3)不同于PCR，引物的退 火温度（Tm)不再是设计时的主要考虑因素；4)推荐针对目标区域，设计多对引物进行优化 筛选，以获得最佳扩增效果；5)扩增产物为单一条带，无非特异扩增。 荧光探针（图1)，是一条寡核苷酸单链，特异性结合与目标区域内，1)长度为 46_52nt ;2)共4个修饰位点：中部距离5'端约30nt位置标记一 dSpacer，即四氢咲喃 (THF)，作为核酸内切酶识别位点；THF位点两侧分别标记一个荧光基团与一个淬灭基团， 两基团间距为2-6nt ;3'末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，例如C3-spaCer、磷 酸基团、生物素、生物素-TEG或胺基；3)序列选择时需注意避免：与引物形成二聚体、存在 非特异结合位点、多个重复序列、形成内部二级结构；4)探针的Tm值不是设计的主要考虑 因素；5)荧光基团可选？六1、冊乂、￥1(：、1(^、了61 &8 1^(1、〇73、〇75或了41狀，检测时根据各荧 光基团的激发波长与发射波长选择对应的检测通道；6)淬灭基团可选BHQl或BHQ2,尽量降 低检测的背景荧光噪音。 重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白、与核酸外切酶，是经基因工程改造 的重组工程酶，包括：1)均来源于天然菌中的有特定功能的活性蛋白，后经基因工程改造； 2)在体外经化学试剂，例如IPTG，或温度的诱导后，在发酵培养的大肠杆菌细胞内可获得 大量表达的目的蛋白；3)细胞破碎后，均经过两次蛋白纯化，例如镍柱纯化与肝素柱纯化， 从而获得高纯度的单一蛋白；4)纯化后，蛋白经过酶活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光探针法常温等温核酸扩增法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)恒温条件下，单链结合蛋白将双链的母链局部打开成单链；(2)重组酶与引物结合成复合体，在辅助蛋白的作用下结合到母链上，荧光探针也与互补区域结合，所述的荧光探针中部标记有四氢呋喃，四氢呋喃两侧分别为荧光基团和淬灭基团，荧光基团和淬灭基团之间间距为2‑6nt，荧光探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团；(3)DNA聚合酶结合到引物的3’末端，进行子链的延生；(4)核酸外切酶识别双链状态下的荧光探针上的四氢呋喃位点，酶切后使荧光基团和淬灭基团得以分离，释放荧光；(5)荧光探针被切断后，露出了原本被探针3'末端修饰所封闭掉的3'‑OH端，DNA聚合酶可以继续延伸形成子链；(6)通过检测扩增曲线的形状，和荧光信号的强弱，可对待测样本进行定性且半定量检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李贤祯，周国辉，程奇，
申请(专利权)人：浙江泰晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33