本发明专利技术公开了肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株，敲除了ssrA基因689位至ssrB基因63位氨基酸共计915个碱基对的缺失菌株。本发明专利技术还公开了肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株的构建方法，步骤包括：(1)获取ssrAB的SN和SC基因，并OverLap PCR进行上下游同源臂的连接；(2)重组自杀质粒pWM91‑ssrAB的构建；(3)细菌的固相接合；(4)G9‑2012(ΔssrAB)的筛选和获得。本发明专利技术的有益效果在于G9‑2012(ΔssrAB)菌株在体内的定殖率减低，毒力明显减弱，可用于研制肠炎沙门氏菌减毒活疫苗或活载体疫苗，进而减低人或动物感染该病原菌的几率，保障人类的健康。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于基因缺失株研 究的
技术介绍
肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis)是重要的食源性人兽共患病原，不仅引 起人类胃肠炎等疾病，也是导致禽蛋及其相关产品污染的主要病原。沙门氏菌是一个典型 的食物污染源，在被污染的食物或者水中可以非常容易地将其分离并检出。据统计，每年超 过一百万的人口被鼠伤寒沙门氏菌或者肠炎沙门氏菌感染，而这些被感染的人群中得到及 时有效治疗的不足1 %。由肠炎沙门氏菌引起的食物中毒，在世界各国都有发生且数量不断 增加，已成为国际公共卫生部门关注的重要问题。目前对于该病原菌的防治缺乏有效的方 法，因此有待深入研究该病原菌的致病因子。 沙门氏菌的致病因子主要在于其毒力岛（SPI)上，目前已经报道的毒力岛大约为 39个，分别加以编号SPI-I到SPI-39,沙门氏菌利用其毒力岛上的三型分泌系统T3SS向宿 主细胞内分泌一些致病因子，目前已知在SPI-I和SPI-2上都有T3SS的存在。而位于这两 个毒力岛上的两个T3SS所起的作用却截然不同，SPI-I上T3SS主要在沙门氏菌的入侵宿 主细胞过程中起到重要作用，其中的某些蛋白属于沙门氏菌的侵袭素，SPI-2上的T3SS主 要在沙门氏菌入侵宿主细胞后的维持中起到重要作用。ssrAB基因是位于SPI-2上的基因， 该基因是SPI-2上T3SS的正调苄基因，其缺失可以引起整个SPI-2表达水平降低，而SPI-2 又与沙门氏菌感染后在宿主细胞内的定殖能力有关，若将该基因进行缺失，理论上可以获 得毒力减弱的菌株。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株及其构建方 法。 专利技术主要利用分子生物学方法和基因工程技术对肠炎沙门氏菌SPI-2上的毒力 因子ssrAB基因进行缺失，构建肠炎沙门氏菌的ssrAB基因缺失菌株G9-2012 ( Δ ssrAB)， 其微生物保藏号是：CGMCC NO. 10422,其分类命名为肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis);保藏时间是：2015年1月22日；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心。 本专利技术对该缺失菌株的生物膜，定殖能力及致病性等进行研究，为进一步肠炎沙 门氏菌基因缺失活疫苗及活载体疫苗的研发做铺垫，从而降低人与动物感染肠炎沙门氏菌 的机率，保障人与动物的健康。 本专利技术是通过以下技术方案来实现的。 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株，敲除了 ssrA基因689位至ssrB基因63位氨 基酸共计915个碱基对的缺失菌株。 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株的构建方法，步骤包括： (1)获取SsrAB的SN和SC基因，并OverLap PCR进行上下游同源臂的连接： 根据ssrAB基因序列，设计引物： ssrAB-NF ： 5-ATAGCGGCCGCCGCTGAGCGAGCTAACAAAC-3 ssrAB-NR : 5-TATCCAGGCCCAACTGCCAGGGTGGTAACA-3 ssrAB-CF ： 5-CTGGCAGTTGGGCCTGGATATCATTCCTCA-3 ssrAB-CR ： 5~GCGCTCGAGAGCGCTTGTCGAATATCGTC~3 以G9-2012菌株制备的DNA为模板，分别扩增ssrAB基因5'端上游同源臂序列 925bp和3'端下游同源臂序列796bp，其中在ssrAB-NR的5'端加入与ssrAB-CF的5'端互 补配对的10个碱基，在ssrAB-CF的5'端加入与ssrAB-NC的5'端互配对的10个碱基，使 得ssrAB-NR和ssrAB-CF之间的碱基配对达到20个碱基，ssrAB-NF和ssrAB-CR引物5'端 分别加限制性酶切位点NotI和XhoI及保护性碱基，ssrAB-NF的GCGGCCGC以及ssrAB-CR 的CTCGAG分别为酶切位点； ssrAB-NF 和 ssrAB-NR，ssrAB-CF 和 ssrAB-CR 二对引物扩增后获得 ssrAB 基因 的上游同源臂和下游同源臂，目的条带大小分别为925bp和796bp，并用0. 8%的琼脂糖电 泳，切胶称重，加入等倍体积的溶胶液PN，50°C水浴放置lOmin，其间不断温和地上下翻转 离心管，以确保胶块充分溶解，转移溶解后的液体于微型柱子，室温放置2min后12830g离 心lmin，弃废液，加入漂洗液PW 600uL，并12830g离心lmin，弃液体，重复洗涤，而后空管 12830g离心2min，将柱子在室内放置lOmin，并转移柱子与干净的I. 5mL的离心管中，并加 入30uL的洗脱液12830g离心lmin，收集离心液，即为经过纯化的上游同源臂925bp片段和 下游同源臂796bp片段，命名为SN, SC片段； 以SN和SC为模板，ssrAB-NF和ssrAB-CR为一对引物，通过OverLap PCR扩增并 连接获得ssrAB基因两侧同源臂序列1701bp ; ssrAB-NF和ssrAB-CR为一对引物扩增后获得OverLap PCR产物，目的条带大 小1701bp，并用0. 8%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入等倍体积的溶胶液PN，50°C水浴放置 lOmin，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，转移溶解后的液体于微型 柱子，室温放置2min后12830g离心lmin，弃废液，加入漂洗液PW 600uL，并12830g离心 lmin，弃液体，重复洗涤，而后空管12830g离心2min，将柱子在室内放置IOmin,并转移柱子 与干净的I. 5mL的离心管中，并加入30uL的洗脱液12830g离心lmin，收集离心液，即为经 过纯化的1701bp片段，命名为sr片段； (2)重组自杀质粒pffM91-ssrAB的构建： 用 NotI 和 XhoI 酶切自杀质粒 pffM91 体系如下：10 X H BufferlOuL, BSAIOuL NotI IuL, XhoI IuL,质粒 pffM9110uL, CldH2O 68uL，37°C水浴 6h，同时用 NotI 和 XhoI 酶切 sr 片 段，体系如下：10 XH BufferIOuL, BSAIOuL NotI luL，XhoI IuL, sr 片段 30uL, CldH2O 48uL， 37°C水浴6h，切胶回收并纯化，利用T4DNA连接酶进行酶连，酶连体系为20uL :sr片段酶切 产物 12uL,质粒 pffM91 酶切产物 5uL，10XT4Ligase Buffer 2uL，T4Ligase luL，16°C连接 过夜，然后热应激转化入大肠杆菌SMlO感受态细胞中，涂布添加有终浓度为lOOug/mL氨苄 青霉素的LB琼脂培养基上，37°C培养过夜，挑取单个菌落于涂布添加有终浓度为lOOug/mL 氨苄青霉素 LB液体培养中，37°C，180g进行过夜培养，提取质粒进行验证，用NotI和XhoI 双酶切验证重组质粒； (3)细菌的固相接合： 采用固相滤膜杂交方法，将G9-2012四区划线至涂布添加有终浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株，其特征在于，敲除了ssrA基因689位至ssrB基因63位氨基酸共计915个碱基对的缺失菌株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李郁，陈传荣，曹堃，孙裴，魏建忠，罗聪玉，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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