一种间充质干细胞的分离及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种间充质干细胞的分离及应用，主要涉及经关节镜手术获得大量来自关节各组织的间充质干细胞液，采用分段收集、离心等程序，富集其中细胞成分进行培养与扩增；富集的细胞经过贴壁生长、增殖、分化以及外源微生物污染检测等程序后，参照国际ISCT推荐的间充质干细胞标准对富集的干细胞纯度和均一性的鉴定分析，最后分别储存于主细胞库与工作细胞库用于细胞治疗。本发明专利技术充分利用了关节镜手术后的废弃液，分离出干细胞用于患者治疗。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 所属
本专利技术涉及，并提供了一种关节镜冲洗液来源间 充质干细胞的分离方法和再生修复治疗上的应用，属于医学

技术介绍
关节镜是一种观察关节内部结构的直径5_左右的棒状光学器械，是用于诊治关 节疾患的内窥镜。该器械从1970年开始推广应用。关节镜在一根细管的端部装有一个透 镜，将细管插入关节内部，关节内部的结构便会在监视器上显示出来。因此，可以直接观察 到关节内部的结构。关节镜不仅用于疾病的诊断，而且已经广泛用于关节疾病的治疗。关 节镜手术是一种微创手术，开始主要应用于膝关节，后相继应用于髋关节，肩关节，踝关节， 肘关节及手指等小关节等。 随着内镜技术在我国逐渐普及，关节镜手术已成为骨关节外科常规诊疗手段。至 今在全身各系统内镜中，关节镜功能最全面、应用最广泛，并由此形成独立的关节镜外科。 关节镜手术业务成为医院和科室绩效的增长点。 2008年，中国共有790个医院拥有关节镜系统设施，可以实施关节镜手术，这些医 院主要集中在三甲医院；到了 2012年，中国共有2640个医院拥有关节镜系统设施，可以实 施关节镜手术，平均年增长率35%，覆盖几乎所有的三级医院和约30%的二甲医院。医院 采购关节镜系统的预算并未受到经济危机和中国经济减速的影响。在北京、上海等一些发 达城市其关节镜技术水平已经能够和发达国家媲美。关节镜手术已经开始从城市三级医院 转向基层，适合我国国情，最大限度的覆盖了人群。 关节镜手术可治疗关节内各种炎症.如骨性关节炎滑膜炎、创伤性关节炎、类风 湿性关节炎、结核性关节炎、化脓性关节炎，剥脱性骨软骨炎等，以及滑膜软骨瘤病；髌骨软 化症；骨赘（骨刺），游离体，滑膜皱壁，关节紊乱症，半月板损伤，关节囊粘连，各种关节内 骨折，各部关节粘连及关节活动受限，各种不明原因的关节痛。 关节镜手术和关节切开术相比，具有下列优点：切口小，美观，可避免晚期因关节 表面和运动部位的瘢痕而引起的刺激症状；属于微创手术，痛苦小，术后反应较小，患者易 于接受；术后早期即可活动和使用肢体，避免长期卧床并发症，减少护理人员和费用；并发 症相对较少；基本不影响关节周围肌肉结构，术后可早期进行功能锻炼，防止关节长期固定 引起的废用和并发症；可以在近乎生理环境下对关节内病变进行观察和检查，有"把眼睛 和手指放入关节内"之称，可对关节进行动力性检查，提高了诊断能力，某些疾病如滑膜皱 襞综合征，是通过关节镜才确立的；关节镜可施行以往开放性手术难以完成的手术，如半月 板部分切除术等。禁忌症少，如身体条件差不能行常规手术，但不一定禁忌关节镜手术。 关节镜也具有一些缺点，一是并非每个医生均有耐心进行关节镜手术，因为需经 小切口用精细和易损的器械进行操作。二是在紧张的关节间隙内操作器械可能对关节软骨 产生明显磨损和划痕，尤其是没有经验的医生。三是在最初使用关节镜操作时可能很费时 间。四是专用器械繁杂而昂贵。 以上文献资料表明，对关节各组织如软骨组织、滑膜、滑液等，进行关节镜手术时 所产生的大量冲洗液并没有充分利用，在手术过程中直接丢弃，而手术所需的干细胞通过 其它方式获得，虽然所获得的干细胞排异低，还是会造成手术费用较高。
技术实现思路
本专利技术采用的技术方案包括：取经关节镜手术获得大量来自关节各组织（软骨组 织、滑膜、滑液）的间充质干细胞液，采用分段收集、离心、膜过滤等程序，富集其中细胞成 分进行培养与扩增；富集的细胞经过贴壁生长、增殖、分化以及外源微生物污染检测等程序 后，参照国际ISCT推荐的间充质干细胞标准对富集的干细胞纯度和均一性的鉴定分析，最 后分别储存于主细胞库与工作细胞库用于细胞治疗。 因此，本专利技术提供关节镜冲洗液来源间充质干细胞在再生修复中应用，步骤包 括： (1)关节液收集：用无菌的收集管对关节镜手术过程中冲洗液进行分段收集冲洗 液，保存备用； (2)将分段收集冲洗液在500g离心10~20min，所得细胞分别加入培养液后重新 悬浮，按3X IO5Ail浓度接种到培养瓶及事先放置有消毒盖玻片的12孔板中培养，培养液 为含15% FBS的L-DMEM培养液，培养5~7d去除未贴壁的细胞后，获得贴壁细胞； (3)合格供体材料档案：参照国际间充质干细胞标准对贴壁细胞进行纯度和均一 性的鉴定分析，确定合格的间充质干细胞，建立相关档案，同时对合格的干细胞进行传代， 4~5d传代一次； (4)间充质干细胞的成软骨分化：将培养传代3次以上的干细胞，制成浓度为 4X 105/ml的悬液，取Iml细胞悬液于15ml塑料离心管中，500g离心15min，使其形成细胞微 团，小心吸去培养液，加入2ml无血清软骨诱导培养液，然后置于二氧化碳培养箱中培养，4 天后首次换液，以后隔2天换液，在培养21天后取出培养的细胞团，检测成软骨分化效果； (5)植入再生修复效果：将合格的间充质干细胞按一定浓度植入患者关节处，观 察关节再生修复效果。 在一个具体实施方案中，步骤（1)所述保存条件是在无菌条件下，4°C储存小于4 小时，运输过程中维持在4°C环境下。 在一个具体实施方案中，步聚（2)和（4)中所述细胞培养环境条件为37°C、5% CO 2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。 在一个具体实施方案中，步聚⑷中所述无血清软骨诱导培养液是指高糖 DMEM(H-DMEM)含 TGF-β llng/mL、地塞米松 ΚΓ 7mmol/L、维生素 C 50mg/L，胰岛素 6. 25ng/ L，转铁蛋白6. 25ug/mL，牛血清白蛋白I. 25ug/mL。 所述间国际充质干细胞标准是指参照国际细胞治疗学会（ISCT)推荐的间充质干 细胞标准如 CD44、CD90、CD105、CD147、CD271、CD166 等。 在一个具体实施方案中，步聚（5)中所述植入干细胞浓度在50~4X 107/ml。 技术效果 1、本专利技术充分利用丢弃的关节镜冲洗液中的间充质干细胞，用于针对关节软骨病 变的再生修复治疗。 2、通过废弃物再利用能获得大量干细胞，这将大大满足患者对干细胞的需要，也 减少了动用患者其它部分干细胞的机率，免受二次手术伤害。 3、通过大规模培养通过关节镜冲洗液中的间充质干细胞，能大大降低了患者的医 疗成本，提高了手术的成功率。 4、该方法获得的间充质干细胞分散性较好，不需要借助酶分离开，减少感染的机 率，也有利于间充质干细胞的稳定。【附图说明】 图1、培养的间充质干细胞PO代光镜下的形态图； 图2、培养的间充质干细胞Pl代光镜下的形态图； 图3、培养的间充质干细胞P2代光镜下的形态图； 图4、培养的间充质干细胞P3代光镜下的形态图； 图5、培养的间充质干细胞成软骨分化的阿尔新蓝染色。【具体实施方式】 下面，本专利技术将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一 个或类似实例。 实施例1 : 用无菌的收集管对关节镜手术过程中冲洗液进行分段收集冲洗液，在无菌条件 下，4°C储存小于4小时，运输过程中维持在4°C环境下。将分段收集冲洗液在500g离心 10~20min，所得细胞分别加入培养液后重新悬浮，按3 X 105/ml浓度接种到培养瓶及事先 放置有消毒盖玻片的12孔板中培养，37°C、5% CO2、饱和湿度的二氧化本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术提供一种间充质干细胞的分离及应用，步骤包括：1)关节液收集：用无菌的收集管对关节镜手术过程中冲洗液进行分段收集冲洗液，保存备用；(2)将分段收集冲洗液在500g离心10～20min，所得细胞分别加入培养液后重新悬浮，按3×105/ml浓度接种到培养瓶及事先放置有消毒盖玻片的12孔板中培养，培养液为含15％FBS的L‑DMEM培养液，培养5～7d去除未贴壁的细胞后，获得贴壁细胞；(3)合格供体材料档案：参照国际间充质干细胞标准对贴壁细胞进行纯度和均一性的鉴定分析，确定合格的间充质干细胞，建立相关档案，同时对合格的干细胞进行传代，4～5d传代一次；(4)间充质干细胞的成软骨分化：将培养传代3次以上的干细胞，制成浓度为4×105/ml的悬液，取1ml细胞悬液于15m1塑料离心管中，500g离心15min，使其形成细胞微团，小心吸去培养液，加入2ml无血清软骨诱导培养液，然后置于二氧化碳培养箱中培养，4天后首次换液，以后隔2天换液，在培养21天后取出培养的细胞团，检测成软骨分化效果；(5)植入再生修复效果：将合格的间充质干细胞按一定浓度植入患者关节处，观察关节再生修复效果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：向华，
申请(专利权)人：向华，
类型：发明
国别省市：湖南;43