本发明专利技术涉及一种鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2的试剂盒，其中包括用于鉴别布鲁氏菌疫苗株A19的特异性引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2的特异性引物对SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；使用该试剂盒在通过PCR扩增-电泳检测区分布鲁氏菌和其他常规细菌菌株后，对于PCR扩增产物进一步测序分析，通过测序结果能够快速有效的鉴别诊断临床样本中布鲁氏菌A19和S2疫苗株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2 的试剂盒。
技术介绍
布鲁氏菌病（Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌引起的一种广泛分布于世界各 地的人畜（兽）共患传染病，其不仅影响畜牧业的健康发展而且危害人类公共卫生健康。 根据国家卫计委公布的全国法定传染病疫情数据，2014年我国人感染布鲁氏菌病人数为 57222,发病率比2013年增长了 31. 48%。人感染布鲁氏菌病的传染源主要来源于感染的动 物及被污染的畜产品，因此，控制和消灭动物布鲁氏菌病，是防止人类感染布鲁氏病的根本 保障。 目前疫苗免疫仍是控制动物布鲁氏菌病的主要措施之一。当前国外主要使用的布 鲁氏菌疫苗株是牛种S19株和RB51株以及羊种Rev. 1株，这些疫苗株我国目前尚未引进和 使用。我国使用的疫苗株主要是牛种布鲁氏菌A19疫苗株和猪种布鲁氏菌S2疫苗株，以前 还曾使用过羊种M5-90疫苗株，由于毒力问题现在暂时不再使用。A19和S2疫苗株的使用 为我国动物群布鲁氏菌病的防控提供了重要保障，但是也存在着无法鉴别疫苗株与野毒感 染株的关键技术瓶颈问题。虽然竞争ELISA(cELISA)和荧光偏振实验（FPT)以其高通量以 及操作方面的优势，在布鲁氏菌弱毒疫苗与野生菌株感染的血清学鉴别有一定的应用，但 是对未知背景的血清样本来说，单次检测仍不能确切分辨疫苗免疫或野毒感染。从病原学 方面鉴别诊断布鲁氏菌野毒株核酸，可以准确判断动物体是否带菌，为布布鲁氏菌病阳性 动物的检疫淘汰提供支撑。因此，利用分子生物学方法，依据疫苗株与其他布鲁氏菌毒株基 因组差异碱基序列，通过PCR扩增及PCR产物序列测定，可有效实现疫苗株与野毒株的分子 鉴别，将其应用于临床鉴别，可以为我国A19和S2疫苗株的鉴别提供技术保障。
技术实现思路
专利技术人通过基因组序列比对，发现与其他布鲁氏菌属细菌基因组DNA序列不同的 是，A19疫苗株在基因组22840位点处，即SEQ ID No. 5的344位点处，缺失7个核苷酸序 列，该位点后序列为AGATTTCAGA，其他布鲁氏菌序列为AGATTTCAGATTTCAGA，因为此处为 AGATTTC的重复序列，所以在序列比对时会出现两种序列缺失现象（AGATTTC或TTTCAGA)。 在该缺失位点上下游处设计引物，通过PCR扩增后序列测定，序列比对以及测序峰图的不 同就可以特异性鉴别牛种布鲁氏菌A19疫苗株。同样我们发现猪种布鲁氏菌S2疫苗株在 基因组246967位点处，与其他布鲁氏菌属细菌基因组相比，S2疫苗株在该位点处，即SEQ ID No. 6的369位点处缺失25个核苷酸序列（TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)，根据该缺失 序列，本专利技术设计扩增引物，通过序列比对与峰图中是否出现套峰就可以将其与其他布鲁 氏菌野毒株或疫苗株进行鉴别，以上是提出本专利技术的技术依据。 本专利技术的目的是提供一种鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2的试剂盒及其 使用方法，该试剂盒能够特异地鉴别临床样本中布鲁氏菌A19和S2疫苗株。 为实现本专利技术目的，采用如下技术方案： 鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株A19和S2的试剂盒，该PCR试剂盒由PCR反应液、 DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成； 所述PCR反应液包括鉴定并测序A19疫苗株和S2疫苗株特异性核苷酸序列的引 物对，其中鉴别A19疫苗株的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示，鉴别S2疫苗株的上游引物序列如SEQ ID No. 3所示，下游引物序列如SEQ ID No. 4所示。分别如下： SEQ ID No. 1 :5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3' SEQ ID No. 2 :5'-GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3' SEQ ID No. 3 :5'-CCTGCTGAGCGATGACCACCA-3' SEQ ID No. 4 :5'-CCGCCAGAACATGCGATTTGA-3' 所述阳性质控标准品包括牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品和猪种布鲁 氏菌S2疫苗株阳性质控标准品； 所述牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品由含有562个碱基的核苷酸片段构 成的PEASY-T3重组质粒组成，所述猪种布鲁氏菌S2疫苗株阳性质控标准品由含有539个 碱基的核苷酸片段构成的PEASY-T3重组质粒组成。 所述含有562个碱基的核苷酸片段的序列如SEQ ID No. 5所示： SEQ ID No. 5 ： 5'-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCACCCTTTACCGTCGCATCATTGCAGACGATCATGCATTCG CGGCCCGATACGCGCCCGATGCCGGTGATGAAGCCAGCGGCGGGCGCTGCCCCGCCATACATGCCATGCGCTGCCGT CAGCCCCAGTTCCAGAAAGGGGGAACCCGGATCGAGCAATTGCGCCACGCGCTCACGGGGCAGAAGTTTTCCGCGCG AAACATGGCGGTCGCGCGCTTTCTCGCCGCCGCCGTCAATGGCAATGCGCGAGGCTTCCGCCACCACGTCGATTGCC GCCAGCATGGCCTTGCGGTTGGCCTCGAAGCTTGCGCTGCGCGTCGAGATTTCAGAACCGGCATCAACGGGTCTCCT GAAAGAGTTCCCGTCCGATCAGCATACGCCGGATTTCCGACGTGCCCGCGCCGATTTCATAAAGCTTGGCATCGCGC AAAAGGCGGCCCGTCGGATAATCGTTGATATAGCCGTTGCCGCCGAGAGACTGGATCGCCTGCAAGGCCATCTGCGT GGCATTTTCCGCAGAGTAAAGAATGCAGCCCGCC-3' 所述含有539个碱基的核苷酸片段的序列如SEQ ID No. 6 : SEQ ID No. 6 ： 5' -CCTGCTGAGCGATGACCACCACCGAGCCGCGGTCGAACACGGCAAGCTGATTGGCCTGTTTGGAAC GGTCGGCAAGCTCGCGCATGAAGGGCGTGGCGAAGGAGGCAAGCCTGCGCACCGGCGCATGGAGTTGCGCAAGCCCG AACAGCTTCAGCGTCAGTGAATAACGGTCGCCATCGAGTTTGGTGACATAGCCGCGCTTCACCAGCCGGTCCAGCAT CCGGTAAAATTCGTTGGGGCTGCGGTCGAGATGCTTGGCGATCTCGGCCTGTGTCAGCCCGCCATCCACACTCGCCA GCAATTCCAATATGTCCAGCCCCTTGTCCAGCGCGGGCGCGCGATAGCGATCGTCAGTTTCCAAGGTCGGCTACGAA CAGCGTAAAGGGTGAAAGGAATAACCACCCGCAAATCGCCTTGACCATGTTTGAATAATATGTT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于鉴别布鲁氏菌野生菌与疫苗株A19和S2的引物组，其特征在于，包括：用于鉴别布鲁氏菌疫苗株A19的引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，用于鉴别布鲁氏菌疫苗株S2的引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何洪彬，赵贵民，王洪梅，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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