用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用。本发明专利技术所提供的试剂盒中含有用于检测呼吸道病毒的引物对组，由4个引物对组成，其序列为序列表中序列1-8。本发明专利技术提供的试剂盒支持高通量，可快速、准确地检测常见呼吸道病毒感染，对于临床而言，能够在1小时内获得4种病毒指标的检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。同时，多指标的检测也可以用于地域性的流行病学调研和疫情监控，以研究呼吸道病毒感染在中国的流行情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸扩增
，涉及一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应 用。
技术介绍
呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，主要病原体包括细菌、病毒、支原 体、衣原体、真菌等，其中主要以病毒性感染为主，特别是上呼吸呼吸道感染中有80%以上 是病毒性的。该病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴，或经污染的用具进 行传播。常于机体抵抗力降低时，如受寒、劳累、淋雨等情况，原已存在或由外界侵入的病毒 或细菌，迅速生长繁殖，导致感染，成人一般5-7天痊愈。 儿童感染呼吸道病原体通常诱发急性呼吸道感染（ARI)，ARI是婴幼儿、儿童常见 疾病，常继发支气管炎、肺炎、副鼻窦炎，少数可并发急性脑膜炎、心肌炎、肾炎、风湿热等， 并发症严重危害儿童的身体健康。已证实95%的ARI由细菌以外的病原体所致，病毒为 ARI主要病原体。不同年龄儿童对病毒的易感性有所区别，据WHO数据显示，呼吸道感染是 世界范围内低龄儿童（〈5岁）死亡的首位原因，每年可造成约500万儿童死亡。儿童急性 呼吸道感染的患病次数平均为3-8次/年，在1岁儿童中感染的比例约1~3%，学龄儿童 至5%~10%。由于各时期流行的病毒种类和型别不尽相同，有时少数几种不同病毒又可 以混合感染，因此对儿童呼吸道病毒病原的监测有着非常重要的意义。早期快速诊断呼吸 道病毒感染能够及时指导临床治疗为合理选择抗病毒抗细菌药物提供依据并在防止抗生 素滥用方面具有重要意义。 呼吸道病毒指能够侵染呼吸道或通过呼吸道进行传播的病毒，至少涉及到8个 科，200多种型别的病毒。呼吸道合胞病毒（RSV)、人偏肺病毒（hMPV)，腺病毒科的腺病毒 (AdV)、细小RNA病毒科的鼻病毒（HRV)等都属于临床常见的可导致呼吸道感染的病毒。目 前检测常见呼吸道病毒的方法较多，但都存在不足，如电镜检测方法复杂昂贵，病毒分离培 养耗时极长且假阴性较多，在拿到培养结果后通常已失去临床意义，酶联免疫法检测的是 病毒特异性抗体但一次仅能检测一种病毒。而基于核酸扩增的核酸检测，由于速度快（通 常3小时内可完成检测）、灵敏度高、特异性好，在病毒检测领域正逐渐成为金标准。 依赖核酸序列的扩增技术（Nucleic Acid Sequence Based Amplification)，即 NASBA扩增技术，是由一对引物介导的、在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩 增的过程。在41°C恒温条件下，在反应速度方面，NASBA扩增Ih可将模板RNA扩增约IO 9~ 1〇12倍，而通常的PCR反应需要2~3h。在检测灵敏度方面，NASBA可以检测到溶液中低 于IOgene copies/μ 1的痕量革El标，而PCR的检测限在100gene copies/μ 1左右。因此， NASBA技术无论是扩增效率还是检测灵敏度都高于RT-PCR技术。而又由于NASBA的反应仅 需要一个41°C的恒温条件，水浴锅即可满足反应要求，不需要复杂的升降温等常规PCR所 依赖的温控设备，因此NASBA技术的仪器成本非常低廉。与相应的检测技术结合，NASBA还 具有操作简便、特异性强等诸多优点。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测呼吸道病毒的引物对组。 本专利技术所提供的用于检测呼吸道病毒的引物对组，由如下4个引物对组成： 由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1 ;由序列表 中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2 ;由序列表中序列5和序列6 所示的两条单链DNA分子组成的引物对3 ;由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA 分子组成的引物对4。 其中，所述引物对I (RSV_TY)用于扩增呼吸道合胞病毒；所述引物对2 (HRV_TY)用 于扩增鼻病毒；所述引物对3(ADV_TY)用于扩增腺病毒；所述引物对4(hMPV_TY)用于扩增 人偏肺病毒。 本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测呼吸道病毒的成套单链DNA。 本专利技术所提供的用于检测呼吸道病毒的成套单链DNA，由探针组和所述引物对组 组成；所述探针组由如下4个单链DNA探针组成：序列表中序列9所示的单链DNA探针1 ; 序列表中序列10所示的单链DNA探针2 ;序列表中序列11所示的单链DNA探针3 ;序列表 中序列12所示的单链DNA探针4。 其中，所述单链DNA探针I (RSV_TY_MB)用于实时监测所述引物对1的扩增结果； 所述单链DNA探针2 (HRV_TY_MB)用于实时监测所述引物对2的扩增结果；所述单链DNA探 针3 (ADV_TY_MB)用于实时监测所述引物对3的扩增结果；所述单链DNA探针4 (hMPV_TY_ MB)用于实时监测所述引物对4的扩增结果。 所述探针组中的每条单链DNA探针的5'端均标记有荧光报告基团FAM，3'端均标 记有荧光淬灭基团TAMRA。 在本专利技术所提供的所述成套单链DNA中，每个引物对及其对应的单链DNA探针可 单独包装在一个包装内。如所述引物对1和所述单链DNA探针1包装在第一个包装内；所 述引物对2和所述单链DNA探针2包装在第二个包装内；所述引物对3和所述单链DNA探 针3包装在第三个包装内；所述引物对4和所述单链DNA探针4包装在第四个包装内。 本专利技术的第三个目的是提供一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒。 本专利技术所提供的用于检测呼吸道病毒的试剂盒，含有所述引物对组或所述成套单 链 DNA。 所述试剂盒还可含有内对照引物对和内对照探针。所述内对照引物对为用于扩增 人基因组中管家基因 GAPDH mRNA的引物对GAPD_IC，由序列表中序列13和序列14所示的 两条单链DNA分子组成。所述内对照探针（GAPD_IC_MB)为序列表中序列15所示的单链 DNA探针，用于实时监测所述内对照引物对（GAPD_IC)的扩增结果。 所述内对照探针的5'端标记有荧光报告基团FAM，3'端标记有荧光淬灭基团 TAMRA0 所述试剂盒中还可含有恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液。 所述恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM pH 8.0的Tris-HCL， 50mM DTT，IOmM dNTP，IOmM rNTP，80mM MgCl2,450mM KC1，15%体积百分含量 DMSO, IM 山梨 醇，20mM四甲基氯化铵。 所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶IU/ μ I，T7RNA 聚合酶5U/ μ 1，核糖核酸酶H 0. 5U/ μ 1，焦磷酸酶0. 5U/ μ 1，RNA酶抑制剂5U/ μ 1，BSA 0. 5 μ g/ μ I 〇 所述试剂盒中还可含有碟式芯片，如24反应腔碟式芯片。 在本专利技术中，所述24反应腔碟式芯片为博奥生物集团有限公司生产的"晶芯 RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪"的配套碟式芯片，其型号为I X 24。 所述碟式芯片的1#至6#反应腔分别存放干燥的如下（1)-(6): (1)所述引物对1和所述单链DNA探针1 ; (2)所述引物对2和所述单链DNA探针 2 ; (3)所述引物对3和所述单链DNA探针3 ; (4)所述引物对4和所述单链DNA探针4 ; (5) 本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测呼吸道病毒的引物对组，由如下4个引物对组成：由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1；由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2；由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对3；由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA分子组成的引物对4。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，盖伟，邢婉丽，马桂红，程京，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11