本发明专利技术属于体外核酸检测领域，目的是提供一种适用于临床样本中沙眼衣原体的快速检测试剂盒，可用于沙眼衣原体的辅助诊断。一种沙眼衣原体的PCR荧光快速检测试剂盒。该试剂盒包含：PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控品、裂解液及蛋白酶K。所述的PCR反应液包含热启动的TaqDNA聚合酶、正反向引物和SYBRGreenI染料，上述引物为针对沙眼衣原体特异序列设计特异性引物，能特异性扩增靶DNA序列，从而达到临床诊断目的。它可以简便快速的检测临床样本中沙眼衣原体感染，具有特异性高、灵敏度高的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外核酸检测领域，本专利技术提供用于检测临床样品中沙眼衣原体 iracAoazaiis，简称CT)的突光PCR试剂盒，用于沙眼衣原体的临床早期诊断。
技术介绍
沙眼衣原体iracAoazaiis)是衣原体属的一类，介于病毒和立克次氏 体间，能通过滤菌器，具有专性细胞内寄生与独特生活周期的原核细胞型微生物。衣原体对 黏膜上的皮细胞尤其是柱状上皮细胞有亲和力，故易引起眼结合膜及泌尿生殖系统黏膜感 染。 我国沙眼衣原体感染居性传播疾病（STD)的第三位，且其发病率有逐年增高的趋 势。目前，沙眼衣原体感染已经成为一个严重的社会问题。一方面衣原体已成为性病中最常 见的一种病原体，另一方面它可出现严重的持续感染现象。沙眼衣原体感染的特点之一是 大部分感染者没有明显的临床症状，最高可有70%的妇女宫颈炎和50%的男性尿道感染是 无症状的携带者，因无自觉症状，这些人在社会上是一个高危的潜在传染源。有学者报道， 经沙眼衣原体阳性母亲产道出生的婴儿，有50%~70%的几率获得衣原体感染，同时注射沙 眼衣原体疫苗后，可以诱发局部特异性免疫，但其保护作用仅能维持1~2年。高发病率、 高构成比是目前国内沙眼衣原体感染的基本流行概况。所以提早诊断衣沙眼原体感染有着 极大的意义。 另外，沙眼衣原体是HIV传播的辅助因子，感染CT的女性发生HIV感染较无 CT感 染的女性高3~5倍，治疗CT可降低HIV的传播。 医院和检测机构常规的沙眼衣原体检测方法是培养法、直接涂片法、免疫学方法， 如免疫荧光法、酶联免疫吸附法等。培养法准确可靠，但是往往需要2~3天，培养周期长， 并且操作繁琐，受样本采集方法和运输方式等影响常常导致阳性率低等缺点，已经满足不 了现代医学快速诊断治疗的步伐；直接涂片法操作简单，但是检测准确率差，依赖于主观判 断；免疫学方法如胶体金技术、酶联免疫吸附法等虽然具有简便快捷等优势，但是存在特异 性差、灵敏度低、假阳性率高等缺点，并不适合临床诊断确诊依据，只能作为初诊方法。 近年发展起来的PCR方法则具有灵敏度高，特异性强等优点，已广泛用于核酸分 析、遗传学检测和临床检测领域。尤其是在原普通PCR的基础上，发展起来的实时荧光PCR 技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的全过程可以 再单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果，避免了 PCR后的处理，是一种先进的分子定量检测技术。荧光PCR技术有多种类型，其定量方式也 不同，主要分为荧光染料嵌入技术、荧光探针技术和自身淬灭荧光技术等。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种沙眼衣原体荧光PCR快速检测试剂盒，它是适用于临床样 本中沙眼衣原体的快速检测的试剂盒，可用于沙眼衣原体感染的辅助诊断。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种沙眼衣原体荧光PCR快速检 测试剂盒，试剂盒包含PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控品、裂解液及蛋白 酶K溶液；PCR反应液中包含了沙眼衣原体特异性的正向引物、反向引物和SYBR Green I染 料； 正向引物序列为：5'-CTATACAGAATCTAATGGCGGAATG-3'， 反向引物序列为：5'-TAGCAAGCAAACACTGACCTTG-3'， 裂解液包括：5. OmM Na0H、10.0 mM Tris-HCl (pH8.0)、0.2mM EDTA(pH8.0)、l%(V/V) TritonX-100,0. 5% (V/V)NP40,0. 5%(V/V)Tween20 ； 阳性质控品与弱阳性质控品是含插入沙眼衣原体特异性保守序列的质粒PCR2. I载 体，该重组质粒转化到大肠杆菌DH5 α中增殖后、经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯 度后用无菌TE缓冲液定量稀释； 阴性质控品是灭菌去离子水。 PCR反应液还包含热启动Taq DNA聚合酶，dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种核苷酸。 本试剂盒保存于-20°c以下，尽量减少反复冻融。 上述正向引物、反向引物的衍生序列也为本专利技术的保护范围，所述衍生序列包括 引物序列的互补链序列，同时还可以向5'端和3'方向延伸一至数个碱基或删减一至数个 喊基得到的序列。 本专利技术采用的是SYBR Green染料嵌入技术。其工作原理是：SYBR Green I染料 能与双链DNA的小沟区域结合，结合后其荧光大大增强，其最大吸收长约497nm，发射波长 最大约为520nm。荧光的强度与DNA双链的量呈现线性关系，因此SYBR Green I染料非常 适合实时监控DNA扩增产物的增加。 本专利技术提供的沙眼衣原体荧光PCR快速检测试剂盒针对沙眼衣原体特异性基因 保守序列设计特异性PCR引物，能特异性扩增靶DNA序列从而达到临床诊断目的。 本专利技术与现有的其它检测技术相比具有以下优点： 1、 相对于常规PCR技术，本产品具有操作简便，结果明了等特点，产物不用凝胶电泳检 测，完全闭管操作，有效的减低了 PCR产物污染的风险； 2、 相对于探针法荧光PCR技术，本产品采用SYBR Green染料法，价格低廉，有效地降低 了生产成本； 3、 检测速度快，整个实验操作仅需2~3个小时，操作简单。 总之，本专利技术提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、操作简单、快速明了等优点， 同时闭管操作，减少后续反应产物带来的污染的可能性，是一种适用于临床样本中沙眼衣 原体的快速检测的试剂盒。【附图说明】 图1是沙眼衣原体检测试剂盒的灵敏度实验数据图，图中横坐标cycle表 示扩增循环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，S1-S7表示浓度为5. OX IO5Copies/μ 1、 5. 0 X IO4Copies/ μ 1 >5. 0 X IO3Copies/ μ I>5. OX IO2Copies/ μ I >5. OX 10copies/ μ I > 5.0C〇pies/l·! 1、5·0Χ10 1Copies/^ 1的阳性质控品扩增曲线，CK为阴性质控品； 图2是沙眼衣原体检测试剂盒的特异性实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增循环 数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，A代表CT阳性质控品扩增曲线，B代表特异性参考品扩增曲 线，特异性参考品分别为大肠埃希菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球 菌、铜绿假单胞杆菌、白色念珠菌、粪肠球菌与淋病奈瑟氏菌； 图3是沙眼衣原体检测试剂盒的阴性实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增循环数， 纵坐标Λ Rn表示荧光强度，A代表CT阳性质控品扩增曲线，B代表20个无菌去离子重复样 本的扩增曲线； 图4是沙眼衣原体检测试剂盒的精密度实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增循环 数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，S2为10份浓度为5. OX IO4Copies/μ 1的阳性参考品扩增 曲线，S6为10份浓度为5. OX lOcopies/μ 1的阳性参考品扩增曲线，CK代表阴性质控品； 图5是沙眼衣原体检测试剂盒的检测限实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增循环 数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，S6为20份浓度为5. Ocopies/μ 1的阳性参考品扩增曲线， 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种沙眼衣原体荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包含PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控品、裂解液及蛋白酶K溶液；所述PCR反应液中包含了沙眼衣原体特异性的正向引物、反向引物和SYBR Green I染料；正向引物序列为：5'‑CTATACAGAATCTAATGGCGGAATG‑3'，反向引物序列为：5'‑TAGCAAGCAAACACTGACCTTG‑3'，所述裂解液包括：5.0mM NaOH、10.0mM Tris‑HCl（pH8.0）、0.2mM EDTA(pH8.0)、1%(V/V)TritonX‑100、0.5% (V/V)NP40、0.5%(V/V)Tween20；所述阳性质控品与所述弱阳性质控品是含有插入沙眼衣原体特异性保守序列的质粒pCR2.1载体，该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中增殖后、经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度后用无菌TE缓冲液定量稀释；所述阴性质控品是灭菌去离子水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨金波，王黎明，刘志新，杜宇平，刘音希，
申请(专利权)人：兰州安康伯乐生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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