一种木榄蛋白激酶CIPK1及其编码基因与应用制造技术

一个来源于木榄的蛋白激酶CIPK1及其编码基因，以及其在培养耐盐提高的转基因植物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种木榄蛋白激酶CIPK1及其编码基因与应用
本专利技术涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种来源于木榄的蛋白激酶CIPK1及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。
技术介绍
盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有4亿公顷，占灌溉农田的1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约0.4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3％以下的土壤上，土壤中过量的Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展(ZhuJK.2002.Saltanddroughtstresssingaltransductioninplants.Annu.Rev.PlantBiol.53：1247-1273；ZhangZL.2011.ArabidopsisFloralInitiatorSKB1ConfersHighSaltTolerancebyRegulatingTranscriptionandPre-mRNASplicingthroughAlteringHistoneH4R3andSmallNuclearRibonucleoproteinLSM4Methylation.PlantCell，23：396-411)。高等植物细胞可通过多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号传递到胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内激活转录因子。激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达，从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。
技术实现思路
本专利技术人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆了一种木榄蛋白激酶(本文命名为CIPK1)的编码基因，并测定了其DNA序列。并且发现通过转基因技术将其导入植株并使其表达后，可显著改善转基因植株的耐盐性，而且这些性状可稳定遗传。本专利技术第一方面提供一种木榄蛋白激酶CIPK1的编码基因(本文命名为BgCIPK1)，其序列为SEQIDNO：2。本专利技术第二方面提供一种重组表达载体，其含有本专利技术第一方面所述的基因，其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述表达载体是pCAMBIA2300；优选地，所述重组表达载体为附图2所示的35S-BgCIPK1-2300载体。本专利技术第三方面提供一种重组细胞，其含有本专利技术第一方面所述的基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。本专利技术第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本专利技术第一方面所述基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本专利技术第一方面所述基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第六方面提供本专利技术第一方面所述的基因、本专利技术第二方面所述的重组表达载体或者本专利技术第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第七方面提供由本专利技术第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。附图说明图1是BgCIPK1基因的植物表达载体(35S-BgCIPK1-2300)构建流程(图1a-1b)。图2是BgCIPK1基因的植物表达载体(35S-BgCIPK1-2300)的质粒图。图3是转BgCIPK1基因的T1代拟南芥植株的耐盐实验结果，T1q4表现出显著的耐盐性，T1q5、T1gq10的结果与其类似，在此未示出。图4为利用反转录PCR对T1代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中BgCIPK1基因的转录水平进行分子水平检测的结果。M为DNALadderMarker(DL2000)，1-8为耐盐T1代转基因拟南芥植株(分别属于T1q4、T1q5、T1q10三个株系)，9-12为非转基因对照拟南芥植株。具体实施方式提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本专利技术。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本专利技术的范围。以下实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自NewEnglandBiolabs公司。在本专利技术中，如果没有注明并且在上下文中没有歧义，比例和百分比是基于重量计算的。实施例1.盐胁迫下木榄SSH文库构建：具体方法为：按照Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建SSH文库(抑制差减文库)。在实验过程中以盐处理的木榄根中提取的mRNA作为样本(Tester)，以未处理的木榄根中提取的mRNA作为对照(Driver)。具体步骤如下：(1)供试材料：木榄采自广东省深圳市福田国家级自然保护区(N22°53′，E114°01′)。采集无虫害、发育良好、成熟程度接近的木榄(Bruguieragymnorrhiza)胚轴，选取大小、长度、重量接近的胚轴用于实验。在塑料桶(盆口径18cm，高15cm)中沙培，每个桶底部垫塑料托盘，细沙为河沙，平均粒径约为1mm，自来水洗净，每个小桶种植胚轴4个。在28℃，自然光照12小时每天的条件下萌发生长苗木培养期间，每天浇适量的自来水补充水分，并且每一周浇一次Hoagland营养液(D.R.HoaglandandD.I.Arnon.Thewater-culturemethodofgrowingplantswithoutsoil.Calif.Agr.Expt.Sta.Circ.347.1950)。(2)材料处理：选择生长发育外观一致(幼苗高度一致、每株幼苗长至6片叶子)的木榄幼苗，分成两组，一组浇2L500mMNaCl，一组浇2L蒸馏水，处理时间为6小时。收集处理组和对照组的根。用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。(3)总RNA提取：分别取对照组和盐处理组的木榄根各3.0g，用植物RNA提取试剂盒(购自Invitrogen)提取总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定所得总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种编码木榄蛋白激酶蛋白的基因编码的蛋白，其序列为SEQIDNO：1。2.编码权利要求1所述的蛋白的基因，其序列为SEQIDNO：2。3.一种重组表达载体，其是通过将权利要求2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；所述表达载体是pCAMBIA2300。4.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的基因或者权利要求3所述的重组表达载体；所述重组细胞为重组农杆菌细胞。5.一种改善植物耐盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建胜，梁远金，王君丹，陈淼，
申请(专利权)人：创世纪种业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44