本发明专利技术公开了一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7、由该细胞株分泌的单克隆抗体及应用。所述杂交瘤细胞株7D7保藏编号为CGMCC No.10877。间接免疫荧光结果表明：7D7杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能特异性识别CAV-2病毒而与MDCK细胞不反应。本发明专利技术制备的7D7与2C1分泌的单克隆抗体的叠加实验结果表明：这两个单克隆抗体为针对CAV-2病毒不同抗原表位的。本发明专利技术所制备的单克隆抗体能很好的和CAV-2反应，可用于临床分离毒株的鉴定。本发明专利技术所制备的7D7单克隆抗体和另一株2C1单克隆抗体是识别CAV-2的两个不同抗原决定簇的单抗，因此说明本发明专利技术的单克隆抗体能用于检测CAV-2病原免疫胶体金试纸条的制备和双抗体夹心ELISA方法的建立。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由 该细胞株分泌的识别不同抗原表位的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
目前，犬腺病毒已知血清型是1型和2型。1962年，Dltehfleld从患呼吸道疾病 的小狗中分离出犬喉气管炎病毒（即CAV-2)，该毒株与1954年Cabass分离的犬传染性肝 炎病毒（CAV-I)在血清学上既相关，但又有明显的差别。 Ditchfleld等经研究已证明CAV-I和CAV-2在毒力、可溶性、抗原结构及红细胞凝 集范围方面的区别。但后来1型腺病毒也可引起单纯的呼吸道疾病，所以CAV-2可以认为是 CAV-I的变异株，经CAV-2免疫的犬能有效地产生针对CAV-I强毒的免疫力。到目前为止， 国外已陆续分离获得多株犬的1型、2型腺病毒，并且在犬和红狐里的携带和发病率较高。 国内关于CAV-2病毒的分离报道相对较少，而CAV-2通常被认为是由CAV-I遗传衍化而来， 因此，研究犬2型腺病毒对于犬的多种疾病的预防与控制具有重要意义。通常分离到的犬2 型腺病毒毒力较弱，相关研究主要集中在其作为载体的应用，而其致病性的研究相对较少。 然而正如禽流感、马传贫、马立克氏等病毒不断遗传一样，犬腺病毒也在不断变异。犬腺病 毒从最初的1型进化到与其差异较大的2型，以呼吸系统感染损伤为主的犬2型腺病毒又 进化到可以感染肠道就是明显证据。所以，犬腺病毒2型必须得被持续的监控下去，这对于 更好地研究其致病规律及疾病预防控制具要意义。 单克隆抗体技术自问世的30多年来发展迅猛，目前已被成功地应用于分子生物 学、免疫学等许多领域的研究。在兽医学研究领域，单克隆抗体在疾病的检测和治疗中发 挥了重要作用。免疫胶体金试纸条具有快速、准确、特异和灵敏的优点，只需少量检测样品， 就能在很短的时间里对样品是否感染做出准确判断，有利于养殖户的早隔离、早治疗，符合 基层养殖单位对于疾病快速诊断的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7。 -株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7,保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保 藏编号为CGMCC No. 10877,保藏日期为2015年5月27日。 本专利技术的目的之二是提供一株上述杂交瘤细胞株7D7分泌的抗CAV-2病毒单克隆 抗体。 本专利技术的目的之三是提供上述杂交瘤细胞株7D7分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体 在制备检测CAV-2病原试剂中的应用，具体表现在以下两个方面： 1、与杂交瘤细胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体用于检测CAV-2病原的免 疫胶体金试纸条的制备； 2、与杂交瘤细胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体用于检测CAV-2病原夹心 ELISA方法的建立。 杂交瘤细胞株2C1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 10878,保藏 日期为2015年5月27日。 本专利技术将实验室保存的CAV-2病毒接种于MDCK细胞上进行增殖，当80%的细胞出 现病变时收获病毒，反复冻融三次，超声30min，12000r/min离心10min，去除细胞碎片及较 大的杂质。取上清，4°C，超速28000r/min 5h，取沉淀，用PBS重悬，12000r/min离心10min， 取其上清过非连续蔗糖密度梯度（60 % -40 % -30 % )，28000r/min离心2. 5h，取其白色 部分，加入大量PBS脱糖，28000r/min离心2. 5h，取其沉淀，用I. 5ml PBS重悬，最终获得 CAV-2纯化的病毒。 ELISA方法检测结果表明：纯化的CAV-2病毒能与CAV-2阳性抗体发生特异性反 应，表明其具有良好的抗原性。 取适量纯化的病毒与弗氏佐剂I : 1混合乳化，免疫6周龄BALB/C小鼠，按常规 方法取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，用纯化的病毒作为检测抗原，建立间接ELlSA方法 对有融合孔的细胞上清液进行检测筛选阳性细胞克隆株，最终得到2株单一的分泌特异性 抗体的杂交瘤细胞克隆，分别命名为7D7,2C1。 间接免疫荧光结果表明：7D7杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能特异性识别 CAV-2病毒而与MDCK细胞不反应。 本专利技术制备的7D7与2C1分泌的单克隆抗体的叠加实验结果表明：这两个单克隆 抗体为针对CAV-2病毒不同抗原表位的单抗。 本专利技术的主要优点如下： 1、本专利技术所制备的单克隆抗体能很好的和CAV-2反应，可用于临床分离毒株的鉴 定。 2、本专利技术所制备的7D7单克隆抗体和另一株2C1单克隆抗体是识别CAV-2的两个 不同抗原决定簇的单抗，因此说明本专利技术的单克隆抗体能用于检测CAV-2病原免疫胶体金 试纸条的制备和双抗体夹心ELISA方法的建立。 保藏信息 一、分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7 分类命名：分泌抗CAV-2单克隆抗体杂交瘤细胞株； 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所； 保藏编号：CGMCC No. 10877 ; 保藏日期：2015年5月27日。 二、分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C1 分类命名：分泌抗CAV-2单克隆抗体杂交瘤细胞株； 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所； 保藏编号：CGMCC No. 10878 ; 保藏日期：2015年5月27日。【附图说明】 图1为CAV-2特异性目的片段，1 :分子量标准DL 1000 ;2 :阴性对照；3,4, 5 :不同 浓度CAV-2目的片段PCR产物； 图2为CAV-2目的片段PCR产物测序结果分析； 图3为纯化后CAV-2病毒蛋白活性的鉴定； 图4为CAV-2各单抗间接免疫荧光的鉴定，a :2C1单抗没接毒对照，b :7D7单抗没 接毒对照，c :sp2/0上清，d :2C1单抗；e :7D7单抗；f :阳性血清对照。【具体实施方式】 下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本专利技术的保护范围中。 本专利技术提供了一种识别不同抗原表位抗CAV-2单克隆抗体的制备方法，具体内容 如下： 1材料和方法 1. 1材料、实验动物与试剂 实验用BALB/c小鼠由中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供；弗氏佐 剂、选择试剂HAT、HT、融合剂PEG购于Sigma公司；标准胎牛血清、培养基RPM11640购于 Gibco公司；抗生素购自大连宝生物工程有限公司。CAV-2由哈尔滨兽医研究所疫病诊断中 心保存。 I. 2CAV-2的培养和基因组DNA的提取 将病毒接种在MDCK细胞上，用含10%牛血清的DMEM培养液培养，待90%细胞发 生病变后收获病毒，将病毒培养物按病毒DNA提取试剂盒说明书上的方法制备基因组DNA 模板。 1.3PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株分泌CAV‑2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7，保藏编号为CGMCC No.10877，保藏日期为2015年5月27日。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王淑杰，蔡雪辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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