一种G蛋白-偶联受体活体示踪方法及应用技术

本发明专利技术涉及分子影像学领域，具体地说是一种G蛋白-偶联受体GPCR活体示踪方法，即在GPCR的非功能区插入一分子增强型绿色荧光蛋白eGFP，构建出一种新型的GPCR-eGFP融合蛋白，以用于GPCR分子的成像和追踪。本发明专利技术以人视紫红质rhodopsin为例，它是广泛存在于脊椎动物视网膜视杆细胞膜上的光受体蛋白，其突变能造成蛋白不能插膜、错误折叠甚至聚集等，引发严重的眼部疾病。因此，构建rhodopsin-eGFP融合蛋白并通过荧光来检测rhodopsin在细胞内的分布情况对于眼病研究具有重要的价值。本发明专利技术首次在rhodopsin的非功能区即第一个胞内环 CL1插入一分子eGFP，实验证明，本发明专利技术构建的新型的rhodopsinCL1-eGFP融合蛋白具有与野生型蛋白相似的表达水平和功能，是rhodopsin相关眼病研究的有力工具。

【技术实现步骤摘要】
一种G蛋白-偶联受体活体示踪方法及应用
本专利技术涉及分子影像学领域，具体地说新型G蛋白-偶联受体(GProtein-CoupledReceptor，GPCR)活体示踪方法，以人视紫红质为例，具体说明在其非功能区即第一个胞内环(CytoplasmicLoop1，CL1)中插入一分子eGFP，成功构建一种新型rhodopsinCL1-eGFP融合蛋白，通过荧光检测rhodopsin在细胞内分布。
技术介绍
G蛋白-偶联受体(GProtein-CoupledReceptor，GPCR)是存在于细胞膜上的参与细胞信号转导的重要蛋白，参与多种重要的生理过程，如突触传递、细胞的增殖和分化以及味觉和触觉的感知等。GPCR均由七个跨膜螺旋构成，螺旋之间由三个胞内环和三个胞外环连接，其N端一般与蛋白的插膜密切相关，而其C端一般是磷酸化位点并参与下游G蛋白的激活，因此具有重要的作用。由于GPCR的重要作用，GPCR突变能导致多种疾病的发生。由于GPCR为真核蛋白，它一般会经历复杂的糖基化加工和折叠过程，只有最终折叠正确的蛋白才能经历从内质网到高尔基体，最后成功插入细胞膜的完整过程。当GPCR突变后，轻者蛋白构象发生改变，重者能引发蛋白的错误折叠，导致蛋白不能正确的插膜，甚至在细胞内发生聚集，并造成细胞死亡等严重后果。因此，GPCR的分子成像具有重要的价值，它能反应GPCR是否正确插膜、表达水平高低以及是否聚集等丰富的信息，这对于研究GPCR相关的疾病具有重要的意义。传统的分子成像方法有组织染色或免疫染色、免疫荧光等方法。即通过特异性的染料或荧光标记特异性抗体结合目标分子，最后借助显色反应或荧光检测来观察目标分子的分布。但上述方法仅适用于固定之后的组织和细胞，无法应用于活体细胞或组织。荧光蛋白的出现极大地带动了分子活体示踪的发展，人们把荧光蛋白和目标蛋白进行融合表达，最后通过荧光在活体细胞或组织中直接观察目标蛋白的分布。绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)具有荧光强度大，干扰因素少，发光稳定等优点，是目前广泛应用的一种荧光蛋白。因此，GPCR-GFP融合蛋白是GPCR分子活体示踪的首选策略。视紫红质(rhodopsin)是广泛存在于脊椎动物视网膜视杆细胞细胞膜上的光受体蛋白，它由一分子配体视黄醛(retinal)和一分子视蛋白(opsin)构成，属于GPCRClassA家族。受到光照刺激后，视黄醛发生异构，促使视紫红质蛋白发生一系列的构象变化，并激活下游的信号传导，继而产生一个传向视神经的信号，最终导致视觉的发生。视紫红质一共有348个残基，但其中有100多个位点的突变与先天性眼病的发生密切相关，如视网膜色素变性和夜盲症等，除少数突变体视紫红质已经得到深入研究外，大部分的视紫红质突变体的研究还处于一片空白。因此探索视紫红质突变与眼病的发生仍具有巨大的发展空间。研究视紫红质在细胞内的分布、转运和表达水平等对于探索视紫红质突变与眼病的发生具有重要的价值。如导致北美人视网膜色素变性最常见的视紫红质P23H，由于突变后的蛋白发生了严重的错误折叠，因此被滞留在内质网中，无法被正常转运到细胞膜上，所以无法执行正常的光受体蛋白功能。P23H的致病原理在细胞水平和动物水平都得到了广泛的验证，这主要得益于rhodopsin-GFP融合蛋白的建立，人们可通过GFP在细胞或视网膜中直接观测rhodopsin的分布。现有技术一般把GFP连接在rhodopsin的C端(CT)，其目的是避免对其N端的干扰，从而达到不影响rhodopsinCT-GFP的插膜的目的。但是由于rhodopsin的C端受到干扰，与野生型rhodopsin相比，rhodopsinCT-GFP的G蛋白转导功能和磷酸化效率大大降低，与野生型rhodopsin有着巨大的差距。显然，rhodopsinCT-GFP不是一个理想的融合表达策略。本专利技术提供了一种改进的rhodopsin-eGFP融合表达策略，即首次在rhodopsin的非功能区-第一个胞内环(CytoplasmicLoop1，CL1)处插入一分子增强型绿色荧光蛋白(enhancedGreenFluorescentProtein，eGFP)，构建出一种新型的融合蛋白rhodopsinCL1-eGFP，从而有效避免对rhodopsin的N端和C端的干扰。经实验证明，rhodopsinCL1-eGFP与野生型rhodopsin呈现相似的糖基化加工和表达水平，并能正确转运到细胞膜上，因此是一种理想的rhodopsin活体示踪指示探针。此外，由于eGFP的荧光强度为GFP的6倍以上，因此rhodopsinCL1-eGFP的荧光强度得到大大增强，从而更加利于荧光检测组织深度的增加。总之，本专利技术为研究rhodopsin相关眼病提供了有力的工具，并为其他GPCR的研究提供有益的参考和新的启发。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种新型GPCR活体示踪方法，具体来说就是通过构建一种新型GPCR-eGFP融合蛋白来直接观测GPCR在活体细胞或组织中的分布位置、表达水平以及状态等，从而为GPCR相关疾病的发病机制的研究提供有价值的参考，并为融合蛋白的构建提供新的思路。本专利技术的特点是eGFP插入在GPCR的非功能区，从而避免对GPCR的功能产生干扰。实现本专利技术目的的具体技术方案是：一种新型G蛋白-偶联受体(GProtein-CoupledReceptor，GPCR)活体示踪方法，特点在于该方法是：在G蛋白-偶联受体的非功能区插入一分子增强型绿色荧光蛋白(enhancedGreenFluorescentProtein，eGFP)，实现GPCR-eGFP融合表达，通过荧光检测GPCR在活体细胞中的分布。所述在G蛋白-偶联受体的非功能区插入一分子增强型绿色荧光蛋白(eGFP)，是在不干扰GPCR功能的前提下，对GPCR分子实现荧光标记，实现GPCR分子的活体实时观测。一种新型人视紫红质(rhodopsin)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合表达方法，其特征在于该方法是：在rhodopsin的第一个胞内环区(CytoplasmicLoop1，CL1)插入一分子eGFP，构建rhodopsinCL1-eGFP；具体包括以下步骤：1)利用分段PCR法在rhodopsin的第一个胞内环区引入一个单点突变K66M，即把第66位的残基赖氨酸突变为甲硫氨酸，在rhodopsin中引入一个独特的NdeI酶切位点(CATATG)；2)pCEP4-rhodopsinK66M质粒转染HEK293S细胞，通过WesternBlot条带确定rhodopsinK66M与野生型rhodopsin在表达量和糖基化加工方面相似，从而确定K66是非关键残基，该位置适合eGFP的插入；3)通过PCR法从pcDNA3.1-3’-eGFP上扩增出两端带有NdeI酶切位点的eGFP基因，然后经NdeI单酶切后，胶回收NdeI酶切后的eGFP基因；4)由于pCEP4质粒上含有多个NdeI酶切位点，不适合进行单酶切实验，用BamHI和HindIII双酶切实验和T4连接酶连接实验把rhodopsinK66M从pCEP4质粒转接到pBAD24质粒上得到pB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种G蛋白‑偶联受体活体示踪方法，其特征在于该方法是：在G蛋白‑偶联受体GPCR的非功能区插入一分子增强型绿色荧光蛋白eGFP，实现GPCR‑eGFP融合表达，通过荧光检测GPCR在活体细胞中的分布。

【技术特征摘要】
1.一种G蛋白-偶联受体细胞示踪方法，其特征在于该方法是：在G蛋白-偶联受体GPCR的非功能区，即第一个胞内环区CL1插入一分子增强型绿色荧光蛋白eGFP，在不干扰GPCR功能的前提下实现GPCR-eGFP的融合表达，通过GPCR分子的荧光标记，实时检测GPCR在细胞中的分布，同时避免eGFP对GPCR重要功能区C端及下游信号传导的干扰。2.一种人视紫红质即rhodopsin和增强型绿色荧光蛋白eGFP融合表达方法，其特征在于该方法是：在人视紫红质的第一个胞内环区CL1插入一分子eGFP，构建rhodopsinCL1-eGFP；具体包括以下步骤：1）利用分段PCR法在人视紫红质的第一个胞内环区引入一个单点突变K66M，即把第66位的残基赖氨酸突变为甲硫氨酸，在人视紫红质中引入一个独特的NdeI酶切位点CATATG；2）pCEP4-rhodopsinK66M质粒转染HEK293S细胞，通过WesternBlot条带确定rhodopsinK66M与野生型rhodopsinWT在表达量和糖基化加工方面相似，从而确定K66是非关键残基，该位置适合eGFP的插入；3）通过PCR法从pcDNA3.1-3’-eGFP上扩增出两端带有NdeI酶切位点的eGFP基因，然后经NdeI单酶切后，胶回收NdeI酶切后的eGFP基因；4）由于pCEP4质粒上含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵欣，姜彩虹，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31