本发明专利技术公开了一种确定大豆球蛋白碱性多肽抑菌机制的方法，属于多肽物质抑菌机理领域。由于抗菌肽结构复杂，作用机制多样，关于大豆球蛋白碱性多肽的抑菌机制属于膜损伤机制还是膜内物质损失机制，目前还没有被阐明。本发明专利技术通过测量细菌细胞内金属离子的泄露，细胞内、外膜的渗透性，对大豆球蛋白碱性多肽的膜损伤机制进行了确定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽物质抑菌机理领域，特别涉及一种确定大豆球蛋白碱性多肽抑菌 机制的方法。
技术介绍
随着生活水平的提高，人们对于食品的营养、安全和保鲜要求不断提高。由于化学 防腐剂对人体的毒副作用，安全无毒的天然防腐剂越来越成为研究热点。 抗菌肽是一种潜力巨大的天然防腐剂。目前许多研究表明，植物源的水解肽有一 定的抑菌特性。大豆球蛋白碱性多肽是通过断裂酸性多肽与碱性多肽之间的二硫键后，通 过等电点沉淀法从大豆球蛋白中提取所得的多肽。已有研究表明大豆球蛋白碱性多肽具有 比青霉素更高的抗菌特性，能明显抑制单细胞李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生 长。 关于抗菌肽的抑菌机制，目前普遍认为有膜损伤和膜内物质损伤机制。由于抗菌 肽结构复杂，作用机制多样，关于大豆球蛋白碱性多肽的膜损伤机制，目前还没有被阐明， 从而严重制约了其在食品防腐中的应用。探究大豆球蛋白碱性多肽的膜损伤机制，将大豆 球蛋白碱性多肽充分应用到食品防腐中，前景将非常广泛，市场潜力巨大。
技术实现思路
为了弥补现有技术无法确定大豆球蛋白碱性多肽的抑菌机理从而抑制大豆球蛋 白碱性多肽在食品防腐中应用的不足，提供一种简便且准确的确定大豆球蛋白碱性多肽抑 菌机制的方法。 本专利技术的技术方案为： ，步骤为： A. 检测大豆球蛋白碱性多肽对微生物细胞离子泄露的影响情况； B. 检测大豆球蛋白碱性多肽对微生物细胞外膜渗透性的影响情况； C. 检测大豆球蛋白碱性多肽对微生物细胞内膜渗透性的影响情况； D. 结果判定：若大豆球蛋白碱性多肽促进微生物细胞离子泄露、大豆球蛋白碱性多肽 促使细胞外膜渗透性增强、大豆球蛋白碱性多肽促使细胞内膜渗透性增强，则大豆球蛋白 碱性多肽的抑菌机制为膜损伤机制；反之为膜内物质损伤机制。 作为优选方案，步骤A、B、C、D所述微生物为大肠杆菌。 作为优选方案，步骤A具体包括： 1) 将对数生长期10s-109cfu/ml的大肠杆菌菌液离心，收集菌体；将所收集的菌体重悬 于0. 8-0. 9%的无菌生理盐水中，并将菌悬液平均分成两组； 2) 向步骤1)两组菌悬液中的一组中加入大豆球蛋白碱性多肽溶液，设为实验组；另一 组中加入等量纯净水，设为对照组； 3) 将步骤2)两组样品在36-38Γ恒温振荡培养，每隔半小时从两组样品中各自取出菌 液，离心收集上清液； 4) 将步骤3)所收集的上清液置于消化杯中，再分别加入浓硝酸和高氯酸85-95Γ水浴 加热，重复多次，直到剩余液体颜色透明为止； 5) 将两组步骤4)所得透明液体分别用纯净水定容，分别测定各组中Ca2+、K+、Mg2+的浓 度变化。 作为优选方案，步骤B具体包括： 1) 将红霉素稀释至0.7、1.5、3、6、25、10(^8/1111，将利福平稀释至0.6、1.25、2.5、5、 10、20 μ g/ml ; 2) 将步骤1)所配制不同浓度的红霉素分别与大肠杆菌菌液和大豆球蛋白碱性多肽混 合均匀，作为实验组一；步骤1)所配制不同浓度的利福平分别与大肠杆菌菌液和大豆球蛋 白碱性多肽混合均匀，作为实验组二； 3) 将步骤1)所配制不同浓度的红霉素分别与大肠杆菌菌液和无菌水混合，作为对照 组一；将步骤1)所配制不同浓度的利福平分别与大肠杆菌菌液和无菌水混合，作为对照组 -* * 4) 将实验组一、实验组二、对照组一、对照组二四组溶液在36-38°C恒温培养3-7h后， 检测其吸光度。 作为优选方案，步骤C具体包括： 1) 将对数生长期10s-109cfu/ml的大肠杆菌菌液离心，收集菌体；将所收集的菌体重悬 于M9乳糖诱导培养基中； 2) 将步骤1)所得菌悬液36-38°C振荡培养8-12h后，离心收集菌体，并将菌体重悬于 β-半乳糖苷酶反应缓冲液中； 3) 将大豆球蛋白碱性多肽配制成浓度为50、100、200、400 μ g/ml的溶液； 4) 将步骤2)所得菌悬液分别与邻硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷以及步骤3)所述不同 浓度的大豆球蛋白碱性多肽溶液混合，36-38Γ持续水浴； 5) 每隔30min，测定步骤4)各溶液的吸光度。 作为优选方案，步骤A 2)中大豆球蛋白碱性多肽溶液的浓度为300-500 μ g/ml。 作为优选方案，步骤B 4)中吸光度的测定波长为600nm。 作为优选方案，步骤C 2)中将菌体重悬于β-半乳糖苷酶反应缓冲液中后，菌悬 液在测定波长为600nm时，满足OD=O. 2 〇 作为优选方案，步骤C 4)邻硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷的浓度为lmg/ml。 本专利技术的有益效果为： 本专利技术通过测量细菌细胞内金属离子的泄露，细胞内、外膜的渗透性，，探索了大豆球 蛋白碱性多肽的膜损伤机制，为大豆球蛋白碱性多肽在食品防腐中的应用提供了理论依 据。 本专利技术方法简单、可靠。【具体实施方式】 实施例1 大豆球蛋白碱性多肽的膜损伤机制的方法，包括步骤： A.检测大豆球蛋白碱性多肽对大肠杆菌细胞离子泄露的影响情况 1)将20ml大肠杆菌菌液(对数期，10s-109cfu/ml)6500r/min离心15min收集菌体。将 所收集的菌体重悬于20ml无菌生理盐水（0. 85%)中，然后将菌悬液平均分成两组。 2)向步骤1)两组菌悬液中的一组中加入大豆球蛋白碱性多肽溶液，使大豆球蛋 白碱性多肽终浓度为400 μ g/ml，设为实验组；另一组中加入等量娃哈哈纯净水，设为对照 组。 3)将步骤2)两组样品恒温振荡（37°C)培养，每隔半小时从两组样品中各自取出 6ml菌液，6500r/min离心15min，收集上清液。 4)将步骤3)所收集的上清液置于消化杯中，再分别加入5ml浓硝酸和Iml高氯 酸，90°C水浴加热到剩余Iml液体，重复多次，直到剩余的Iml液体颜色透明为止。 5)将两组步骤4)所得的Iml透明液体分别用娃哈哈纯净水定容至25ml，用电感 耦合等离子体发射光谱仪分别测定各组中Ca 2+、K+、Mg2+的浓度变化，结果如表1示，与对照 组相比，实验组Ca 2+、K+、Mg2+泄露明显增加。并且随着时间的增加 ，Ca 2+、K+、Mg2+的泄露浓 度逐渐增加，说明大豆球蛋白碱性多肽能通过破坏细胞膜而引起离子的泄露。 表1大豆球蛋白碱性多肽对大肠杆菌细胞离子泄露的影响情况Β.检测大豆球蛋白碱性多肽对大肠杆菌细胞外膜渗透性的影响情况 1) 将红霉素稀释至0.7、1.5、3、6、25、10(^8/1111，将利福平稀释至0.6、1.25、2.5、5、 10、20 μ g/ml ; 2) 将步骤1)所配制不同浓度的红霉素各5ml当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种确定大豆球蛋白碱性多肽抑菌机制的方法，其特征在于，步骤为：A.检测大豆球蛋白碱性多肽对微生物细胞离子泄露的影响情况；B.检测大豆球蛋白碱性多肽对微生物细胞外膜渗透性的影响情况；C.检测大豆球蛋白碱性多肽对微生物细胞内膜渗透性的影响情况；D.结果判定：若大豆球蛋白碱性多肽促进微生物细胞离子泄露、大豆球蛋白碱性多肽促使细胞外膜渗透性增强、大豆球蛋白碱性多肽促使细胞内膜渗透性增强，则大豆球蛋白碱性多肽的抑菌机制为膜损伤机制；反之为膜内物质损伤机制。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李迎秋，孙秀秀，赵国萍，何金兴，赵祥忠，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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