本发明专利技术公开了一种荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法，包括以下步骤：(1)将荧光蛋白标记的生物组织用化学固定手段固定，得到固定的荧光蛋白标记的生物组织；(2)将固定的荧光蛋白标记的生物组织用有机溶剂置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的荧光蛋白标记的生物组织；(3)将脱水后的荧光蛋白标记的生物组织进行包埋剂渗透处理，获得包埋剂单体填充的荧光蛋白标记的生物组织；(4)使所述包埋剂发生聚合反应，获得荧光蛋白标记的生物组织的树脂包埋样品；(5)将所述树脂包埋样品浸泡在碱性溶液中，调节pH值在8至12。本发明专利技术提供的方法，能适用于各种体积的生物组织样本，荧光强度强，成像效果好，样品兼具优良的切削性能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于荧光显微成像领域，更具体地，涉及一种。
技术介绍
树脂包埋样品具有优越的切削性能，是制备电镜超薄组织切片以及电镜或光学断层显微成像用样品的标准方法。但是由于树脂包埋过程中脱水以及有机相处理的过程严重淬灭绿色荧光蛋白及其衍生物，使得树脂包埋技术无法与基于现代分子生物学的荧光标记技术兼容。现有的树脂包埋技术，主要有两种:基于物理固定手段的包埋方法，对于体积较小(厚度不超过0.6毫米)的样本，可使用基于超低温冰冻，冰冻置换和低温聚合的树脂包埋方法使得探测和分析培养细胞和微小组织中的GFP荧光能够顺利进行。但是，除了仍然有荧光淬灭外，这种技术几乎不能移植到宏观体积样品的包埋中，因为冰冻置换无法在厚度超过0.6毫米的样品上均匀的实现，并且同时，基于紫外聚合的低温聚合技术也无法在宏观组织上使用，因为短波长的紫外光无法穿透厚组织，从而无法保证组织内部成功聚合。基于化学固定手段的包埋方法:主要通过将醛类等物质渗透入生物组织，与组织内的蛋白发生反应，相互交联，实现组织的固定；然后通过乙醇等有机溶剂的渗透置换实现脱水，再通过包埋剂单体渗透置换掉脱水剂，使用常规的热聚合实现包埋。但是这种方法不能避免荧光淬灭现象，荧光亮度低，成像效果差。目前的树脂包埋技术，荧光淬灭现象普遍，成像效果不理想，尤其是对于体积较大的生物样本。而且，由于缺乏对树脂包埋过程中荧光蛋白淬灭原理的了解，荧光淬灭现象是不可控的。无论是物理固定手段的包埋技术还是化学固定手段的包埋技术都是经验性的，其可移植性受到严重限制，一种方法往往只适用于特定的组织和荧光蛋白。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种，其目的在于通过在聚合完成后调节树脂包埋样品的PH值，使得荧光蛋白去质子化，从而恢复活性，由此解决荧光成像领域荧光淬灭且淬灭不可控的技术问题。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法，包括以下步骤:(I)将荧光蛋白标记的生物组织用化学固定手段固定，得到固定的荧光蛋白标记的生物组织；(2)将固定的荧光蛋白标记的生物组织用有机溶剂置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的荧光蛋白标记的生物组织；(3)将脱水后的荧光蛋白标记的生物组织进行包埋剂渗透处理，获得包埋剂单体填充的荧光蛋白标记的生物组织；(4)使所述包埋剂发生聚合反应，获得荧光蛋白标记的生物组织的树脂包埋样品;(5)将所述树脂包埋样品浸泡在碱性溶液中，调节pH值在8至12之间。优选地，所述的树脂包埋方法，其碱性溶液的pH在8至12之间，优选pH在10至12之间，更优选pH值为11.2。优选地，所述的树脂包埋方法，其碱性溶液的弱碱溶液或碱性缓冲液。优选地，所述的树脂包埋方法，其弱碱溶液，为碳酸钠溶液、有机胺溶液和氨水中的一种或多种。优选地，所述的树脂包埋方法，其荧光蛋白标记的生物组织为绿色荧光蛋白或其衍生物标记的生物组织。优选地，所述的树脂包埋方法，所述包埋剂为丙烯酸树脂。优选地，所述的树脂包埋方法，其步骤(3)所述包埋剂为热聚合包埋剂时，所述步骤(4)聚合反应温度在50°C至60°C之间。优选地，所述的树脂包埋方法，其步骤(4)聚合反应前，将所述包埋剂填充的荧光蛋白标记的生物组织，置于真空干燥环境，除去包埋剂中的气体。按照本专利技术的另一方面，提供了一种弱碱性溶液应用于恢复荧光蛋白被淬灭的荧光，是通过使荧光蛋白处于PH值8至12的环境实现的。优选地，所述弱碱性溶液的pH值在8至12之间。优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物，如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和增强型黄色荧光蛋白(EYFP)。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果:(I)本专利技术通过碱液激活，使得树脂包埋后质子化的GFP及其衍生物去质子化，从而恢复淬灭的荧光，大幅提高荧光强度，获得高质量的成像效果；(2)本专利技术提供的荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法，兼容现有的树脂包埋方法，不影响现有的树脂包埋剂使用，能保证包埋后样品的硬度，所述方法包埋后的生物组织样品具有优良的切削性能；(3)本专利技术提供的树脂包埋方法，不限制生物组织样品大小，对于体积较大的生物组织样品，仍能取得较好的包埋效果，荧光强度和成像质量好。【附图说明】图1是本专利技术提供的荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法流程图；图2是实施例1碱液激活前后荧光强度对比图；图2 (a)为实施例1碱液激活前荧光强度；图2(b)为实施例1碱液激活后荧光强度；图3是实施例2碱液激活前后荧光强度对比图；图3 (a)为实施例2碱液激活前荧光强度；图3(b)为实施例2碱液激活后荧光强度；图4是实施例3碱液激活前后荧光强度对比图；图4 (a)为实施例3碱液激活前荧光强度；图4(b)为实施例3碱液激活后荧光强度；图5是实施例4碱液激活前后荧光强度对比图；图5 (a)为实施例4碱液激活前荧光强度；图5(b)为实施例4碱液激活后荧光强度； 图6是实施例5碱液激活前后荧光强度对比图；图6 (a)为实施例5碱液激活前荧光强度；图6(b)为实施例5碱液激活后荧光强度；图7 (a)是EGFP分别在蒸馏水、pH = 5的乙酸溶液、GMA单体、GMA树脂聚合物以及碱液激活的GMA聚合物中的吸收光谱曲线图；图7(13)是树脂包埋和碱液激活过程中生色团动力学示意图。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本专利技术提供的荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法，如图1所示，包括以下步骤:(I)样本固定。将荧光蛋白标记的生物组织用化学固定手段固定，得到固定的荧光蛋白标记的生物组织。所述荧光蛋白标记的生物组织，优选为绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物(GFP衍生物)标记的生物组织。化学固定手段，主要指使用固定剂将浸泡所述生物组织，使得生物组织形态保持不变，优选的固定剂有:多聚甲醛溶液(PFA溶液)、甲醛溶液等。一般使用化学固定手段固定后，宜用PBS溶液(磷酸盐缓冲液生理盐水)漂洗。(2)样本脱水。将固定的荧光蛋白标记的生物组织用有机溶液置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的荧光蛋白标记的生物组织。有机溶液置换的具体步骤为:将所述生物组织，依次通过梯度乙醇溶液进行脱水，脱水的程度按照相应包埋剂使用的一般要求。(3)包埋剂渗透处理。将脱水后的荧光蛋白标记的生物组织进行包埋剂渗透处理，获得包埋剂单体填充的荧光蛋白标记的生物组织。其具体步骤为:将所述生物组织依次通过梯度包埋剂溶液进行渗透置换，溶液的浓度梯度按照相应包埋剂的一般浓度处理。所述包埋剂为丙烯酸树脂，可为低温聚合包埋剂或热聚合包埋剂等。低温聚合包埋剂如GMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)树脂Technovit8100、MMA(甲基丙烯酸甲酯)树脂Technovit9100o热聚合包埋剂如伦敦白胶(LRwhite)等。(4)包埋剂聚合。使所述包埋剂发生聚合反应，获得荧光蛋白标记的生物组织的树脂包埋样品。聚合反应前，树脂包埋样品可进本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光蛋白标记的生物组织树脂包埋方法，包括以下步骤：(1)将荧光蛋白标记的生物组织用化学固定手段固定，得到固定的荧光蛋白标记的生物组织；(2)将固定的荧光蛋白标记的生物组织用有机溶剂置换，使得所述生物组织脱水，得到脱水后的荧光蛋白标记的生物组织；(3)将脱水后的荧光蛋白标记的生物组织进行包埋剂渗透处理，获得包埋剂单体填充的荧光蛋白标记的生物组织；(4)使所述包埋剂发生聚合反应，获得荧光蛋白标记的生物组织的树脂包埋样品；其特征在于，还包括以下步骤：(5)将所述树脂包埋样品浸泡在碱性溶液中，调节pH值在8至12之间。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾绍群，龚辉，骆清铭，熊汗青，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。