一种披碱草属植物根尖染色体压片方法技术

本发明专利技术提供一种披碱草属植物根尖染色体压片方法，包括以下顺序的步骤：1)取材；2)预处理；3)固定；4)保存；5)解离；6)染色；7)制片；8)镜检。通过确定关键步骤的处理液及处理时间，为披碱草属植物细胞学特征、遗传机制、遗传育种、基因定位等的深入研究提供标本奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物根尖染色体压片方法，特别涉及。
技术介绍
披碱草属(Elymus L.)是禾本科(Gramineae)小麦族(Triticeae)重要的多年生属，该属是小麦族植物中遗传和物种多样性较为丰富的类群，多数种质饲用价值高，适应性广，抗逆性强，其基因组中含有普通小麦不具有的抗逆基因，可作为改良麦类作物的基因资源库。披碱草属牧草在我国已经广泛种植，并在发展畜牧业和建设生态环境中发挥了巨大作用。除了形态学研究，关于该属的地理分布、细胞学、分子生物学以及资源的评价与利用等方面的系统研究也十分必要，且对于了解披碱草属物种的起源，植物多样性以及遗传育种和资源合理开发等都有特别重要的意义。有关披碱草属植物细胞学方面的研究和报道都很少，国内已有披碱草属部分植物的核型报道，而对中国披碱草属植物进行核型进化程度的研究及通过核型似近系数进行聚类分析、探讨其亲缘关系方面的研究则属空白。染色体是基因的载体，遗传育种中可用于人工创造新物种，培育或改良植物新品种。制备染色体标本是基础，优良的染色体制片技术是进行细胞染色体观察和分析，进行染色体显带、原位杂交等的先决条件，对于进行染色体行为和细胞变异等遗传现象的分析具有重要的意义。鉴定植物的染色体数目是染色体分析的一种非常重要的分析，根尖是有丝分裂的高发区，因而成为染色体计数常用的材料。根尖染色体压片法包括取材、预处理、固定、解离、软化、染色、压片和镜检，每一步的关键是适合的处理液和处理时间。目前，披碱草属植物尚未有这方面的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，通过确定关键步骤的处理液及处理时间，为披碱草属植物细胞学特征、遗传机制、遗传育种、基因定位等的深入研究提供标本奠定基础。本专利技术的技术方案是:，其特征在于包括以下顺序的步骤:I)取材:筛选植物饱满的种子，放入铺有湿滤纸的培养皿中，置于22— 28°C的培养箱中萌发，待根部长到1.5cm时，于上午8:00— 9:00剪取根尖作为实验材料；2)预处理:根尖用清水洗净后，用刀片切取分生区部分0.5cm放入小瓶，然后向其中滴加饱和对二氯苯，室温条件下处理6h ；3)固定:将经过预处理的根尖用蒸馏水清洗干净，然后放入卡诺固定液中，于室温下固定24h ；4)保存:固定后的根尖先用去蒸馏水彻底清洗干净，然后放入70%酒精中，于4°C冰箱中保存备用；5)解离:于2mL离心管中加入混合酶解液置于37°C水浴锅中解离10 — 20min ;6)染色:蒸馏水冲洗材料，用石炭酸品红染液染色20— 40min ;7)制片:于染色后的材料上盖上盖玻片，吸水纸包住后，铅笔头轻敲或拇指轻压；8)镜检:使用10倍显微镜找到所述材料的观察目标范围，然后使用40倍显微镜寻找处于分裂期的细胞，拍摄图片，然后再根据图片对染色体进行计数。步骤4)所述的混合酶为:纤维素酶2g，加果胶酶2.5ml，再加入A+B缓冲液7.5ml制成混合酶1ml ;其中A+B缓冲液为40ml 0.lmol/L柠檬酸+60ml 0.lmol/L柠檬酸钠，在4°C条件下储存，用灭菌蒸馏水稀释10倍后使用。进一步地，所述的步骤I)取材:筛选植物饱满的种子，放入铺有湿滤纸的培养皿中，置于25°C的培养箱中萌发，待根部长到1.5cm时，于上午8:00— 9:00剪取根尖作为实验材料。进一步地，所述的步骤I)取材:筛选植物饱满的种子，放入铺有湿滤纸的培养皿中，置于25°C的培养箱中萌发，待根部长到1.5cm时，于上午8:30剪取根尖作为实验材料。进一步地，所述的步骤5)解离:于2mL离心管中加入混合酶解液置于37°C水浴锅中解离17min。进一步地，所述的步骤6)染色:蒸馈水冲洗材料，用石炭酸品红染液染色30min。进一步地，所述的步骤2)预处理:根尖用清水洗净后，用刀片切取分生区部分0.5cm放入小瓶，然后向其中滴入冰水混合物，最后将小瓶放入4°C冰箱中培养24h。进一步地，所述的步骤5)解离:将固定好的根尖用双蒸水清洗3次，再放入蒸馏水浸泡20min，彻底清除根尖上残留的溶液，然后放入装有I mol/L HCl的离心管中，于室温下保持15—25min进行解离。进一步地，所述的步骤5)解离后，需要用蒸馏水冲洗材料，放入45%醋酸处理30min，软化材料。本专利技术的有益效果是:(I)确定了披碱草属植物根尖染色体压片法根尖的最适萌发温度和最适取样时间，即筛选植物饱满的种子，放入铺有湿滤纸的培养皿中，置于25°C的培养箱中萌发，待根部长到1.5cm时，于上午8:30剪取根尖作为实验材料；这时间段取材能获得较多的细胞分裂相，有利于染色体相关的分析。(2)确定了披碱草属植物根尖染色体压片法的最适预处理液和处理时间，即根尖用清水洗净后，用刀片切取分生区部分0.5cm放入小瓶，然后向其中滴加饱和对二氯苯，室温条件下处理6h ；(3)确定了披碱草属植物根尖染色体压片法的最适解离方法及解离时间，即于2mL离心管中加入混合酶解液置于37°C水浴锅中解离10 — 20min ；(4)确定了披碱草属植物根尖染色体压片法的最适软化时间，即用蒸馏水冲洗材料，放入45%醋酸处理30min ；(5)确定了披碱草属植物根尖染色体压片法最适染色液及染色时间，即蒸馏水冲洗材料，用石炭酸品红染液染色30min。通过确定关键步骤的处理液及处理时间，提供，这将为披碱草属植物细胞学特征、遗传机制、遗传育种、基因定位等的深入研究提供标本奠定基础。【附图说明】图1为本专利技术披碱草属植物无芒披碱草在40倍显微镜下观察到的染色体中期分裂相；图2为本专利技术披碱草属植物老芒麦在40倍显微镜下观察到的染色体中期分裂相；图3为本专利技术披碱草属植物披碱草在40倍显微镜下观察到的染色体中期分裂相。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但不限定本专利技术的保护范围。本专利技术所述的混合酶为:纤维素酶2g，加果胶酶2.5ml，再加入A+B缓冲液7.5ml制成混合酶1ml ;其中A+B缓冲液为40ml 0.lmol/L柠檬酸+60ml 0.lmol/L柠檬酸钠，在4°C条件下储存，用灭菌蒸馏水稀释10倍后使用。实施例一:—种披碱草属植物无芒披碱草根尖染色体压片方法，其特征在于包括以下顺序的步骤:I)取材:筛选无芒披碱草饱满的种子，放入铺有湿滤纸的培养皿中，置于25°C的培养箱中萌发，待根部长到1.5cm时，于上午8:30min剪取根尖作为实验材料；2)预处理:根尖用清水洗净后，用刀片切取分生区部分0.5cm放入小瓶当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种披碱草属植物根尖染色体压片方法，其特征在于包括以下顺序的步骤：1)取材：筛选植物饱满的种子，放入铺有湿滤纸的培养皿中，置于22—28℃的培养箱中萌发，待根部长到1.5cm时，于上午8:00—9:00剪取根尖作为实验材料；2)预处理：根尖用清水洗净后，用刀片切取分生区部分0.5cm放入小瓶，然后向其中滴加饱和对二氯苯，室温条件下处理6h；3)固定：将经过预处理的根尖用蒸馏水清洗干净，然后放入卡诺固定液中，于室温下固定24h；4)保存：固定后的根尖先用去蒸馏水彻底清洗干净，然后放入70％酒精中，于4℃冰箱中保存备用；5)解离：于2mL离心管中加入混合酶解液置于37℃水浴锅中解离10—20min；6)染色：蒸馏水冲洗材料，用石炭酸品红染液染色20—40min；7)制片：于染色后的材料上盖上盖玻片，吸水纸包住后，铅笔头轻敲或拇指轻压；8)镜检：使用10倍显微镜找到所述材料的观察目标范围，然后使用40倍显微镜寻找处于分裂期的细胞，拍摄图片，然后再根据图片对染色体进行计数。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：德英，穆怀彬，赵来喜，解继红，
申请(专利权)人：中国农业科学院草原研究所，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15