本发明专利技术属于生物工程技术领域，特别涉及一种人胃蛋白酶原I(PGI)与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性分泌表达；提供了该融合蛋白的制备方法。本发明专利技术还公开了上述重组BMP-PG I融合蛋白在制备单克隆抗体，胃蛋白酶原I试剂盒校准品中的应用。本发明专利技术利用了Ptac启动子、malE信号肽、麦芽糖结合蛋白等元件实现了PGI在大肠杆菌周至内的可溶性分泌表达，不仅大大提高了来自原核表达系统的重组人PGI蛋白的免疫原活性，并且有效的降低了重组PGI的制备成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体设及一种重组PG I的融合蛋白可溶性分泌表 达及其制备方法和应用。
技术介绍
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和致死率一直居于我国恶性肿瘤之首，早 期诊断和早期介入治疗是降低致死率的关键措施之一。近年来研究发现，血清胃蛋白酶原 任epsinogen，PG)可作为胃癌和癌前病变的血清筛选指标。 胃蛋白酶原（Pepsinogen, PG)是胃蛋白酶的无酶活性的前体，在抑1-5的酸性条 件下转化成有活性的胃蛋白酶。PG有7个同工酶，根据其生化免疫特性可分为PG I亚群 (又称PGA);和PG II亚群（又称为PGC)。血清PG I和PG II反映胃黏膜腺体和细胞的 数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。 正常情况下，胃粘膜分泌的胃蛋白酶原大部分进入胃肠经胃蛋白酶或胃酸水解， 在其N端水解42个氨基酸残基后产生有活性的胃蛋白酶，对蛋白质进行消化，仅有1 %的 PG透过胃黏膜毛细血管进入血液循环。当胃黏膜发生病理变化时，血清PG水平也会发生相 应的变化。因此，PG作为胃病筛查的体外检测越来越受到关注。 阳〇化]目前，人胃蛋白酶原主要从人胃组织中提取，运种传统的提取方法，产品得率低， 并受到材料来源有限的限制，成本高昂，很难实现产业化，所W重组表达高活性的胃蛋白酶 原具有很好的市场前景。 胃蛋白酶原是分子量为42KDa的单链多肤，含有3个连续的二硫键，在原核表达系 统中胞内表达很难正确折叠，蛋白W无活性的包涵体形式存化复性后活性很低。本专利技术利 用ma化天然信号肤将PG I引导至大肠杆菌周至，实现了 PG I蛋白的可溶性分泌表达，重 组表达的PG I蛋白具有很好的免疫原性，本专利技术中的PG I蛋白的N端融合了 MBP蛋白，其 在提高PG I融合蛋白表达量的同时还改善了 PG I蛋白不稳定容易降解的特性。
技术实现思路
本专利技术公开一种利用大肠杆菌表达系统分泌表达重组人PG I融合蛋白的方法； 同时还提供了该融合蛋白的制备方法。 本专利技术还公开了使用上述方法获得的PG I融合蛋白在制备PG I的单克隆抗体中 作为免疫原，W及在胃蛋白酶原诊断试剂中的应用。【附图说明】 图1.本专利技术的包含PG I基因的重组质粒载体构建图； 图2.本专利技术的重组表达PG I融合蛋白的表达及纯化SDS-PAGE电泳图：1、诱导全 菌；2、提取菌体周至蛋白；3、Ni2+馨合亲和柱纯化PG I融合蛋白； W11] 图3.本专利技术制备的PG I融合蛋白作为免疫原所制备的PG I单抗的效价检测； 阳01引图4.本专利技术制备的融合蛋白的PG I活性检测。【具体实施方式】 实施例1 :PG I编码序列的扩增 使用PCR方法从质粒阳T32a-PG I (本公司构建）扩增出PG I的编码序列，所用 的引物PGA35的5'端添加了甜a I的酶切位点，引物PGA33的5'端添加了 Hindlll的酶 切位点。 PGA35：5 ^-AACTCTAGAGGTAGCGGCTCTGGCTCGGGTTCTATTATGTATAAAGTTCCATTGATTAGA AGAAG-3, PGA33 :5> -AACAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGCGACTGGTGCCAAACC-3'100 y 1的PCR反应体系中加入1 y 1的La Taq DNA聚合酶灯aKaRa)，10 y M的 PGA35和PGA33各4 y 1，2. 5mM的dNTP加入8 y 1，10 X PCR反应缓冲液加入10 y 1。PCR的 反应条件为：94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分钟30秒，然 后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中 的目的条带，然后将目的条带切下，溶胶回收。 实施例2 :MBP-PG I融合蛋白表达载体的构建 取2 y g实施例1中PCR扩增得到的PG I编码序列，建立50 y 1的双酶切体系，具 体如下：2 y g的PG I编码序列，5 y 1的10XM酶切反应缓冲液，1. 5 y 1甜a I和1. 5 y 1的 化ndllI，加双蒸水至总体积50 y 1，37°C水浴中反应6小时。使用凝胶回收试剂盒（OMEGA BI0-TEK)纯化PG I编码序列的双酶切产物。 取6(K)ng的pMkp2X(肥B公司）载体，建立50 y 1的双酶切体系，具体如下：600ng 的pML-p2X载体，5 y 1的10XM酶切反应缓冲液，1. 5 y 1甜a I的和1. 5 y 1的Hindlll， 加双蒸水至总体积50iil，37°C水浴中反应6小时。使用凝胶回收试剂盒（OMEGA BI0-TEK) 纯化pMAL-p2X载体双酶切产物。 连接反应：取4 y 1经过纯化的pML-p2X的甜a I和Hindlll双酶切产物，加入 6 y 1经过纯化的PG I的双酶切产物，1 y 1的T4 DNA连接酶灯aKaRa)和1 y 1的10XT4 DNA连接酶反应缓冲液，16°C水浴中连接过夜。 连接产物转化大肠杆菌D册a，然后挑取克隆，送公司测序（感受态D册a的制备 方法及转化方法依照"分子克隆实验指南"第二版所述。J.萨姆布鲁克著）。所得重组质 粒命名为pMAkPG I。 阳02引实施例3 :MBP-PG I融合蛋白的表达 将所获得的pMkPGI质粒转化E.coli化210E3)(Novagen公司）感受态细胞。 细菌的诱导表达：挑取克隆接种于100ml含100 y g/ml氨节青霉素的LB液体培养基中，在 37 °C、250rpm条件下培养过夜，制备种子液。 阳0巧]取10ml种子液接种入装有1L LB-Amp培养基的化锥形瓶，37°C培养至ODe。。为0. 5左右，然后加入终浓度为0. 5mM的1PTG，将溫度降为28°C诱导化后，12000g离屯、获得 菌体。制备全菌电泳样品，蛋白电泳分析目的蛋白表达情况。SDS-PAGE电泳的样品制备方 法、电泳电压、凝胶染色和脱色的方法见"分子克隆实验指南"第二版所述。J.萨姆布鲁克 著。 实施例4 :含有MBP-PG I基因的大肠杆困的周至蛋白抽提 将细胞沉淀悬于新配置的溶菌酶（Img/ml)、20% W/V薦糖、30mmol/LTris、Immol/ LEDTA，p册.0溶液中，冰浴30min，12000g离屯、，收集上清为周至蛋白。 阳02引实施例5 :MBP-PG I融合蛋白的纯化化Trap化elating HP(儀离子馨合亲和柱，GE)纯化蛋白：上样后，先用Wash BufferOOmM T;ris，0.5M 化Cl、80mM imidazole, P册.0)冲洗掉杂蛋白，然后用 Elution Buffer (20mM T;ris，0.5M 化Cl、400mM imidazole, P册.0)洗脱目的蛋白。 实施例6 :MBP-PG I融合蛋白免疫小鼠，制备单克隆抗体 阳03U 1)免疫小鼠：制备的重组MBP-PG I融合蛋白按每只小鼠100 ji g蛋白量与弗氏完 全佐剂等体积混匀乳化，皮下免疫；3周后，二次免疫，50 y g蛋白量与弗氏不完全佐剂等体 积混匀，乳化后本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人PG I融合蛋白的原核表达质粒的构建，其特征是将PG I的基因通过表达质粒pMAL‑p2X或pMAL‑p5X导入大肠杆菌表达菌株，IPTG诱导PG I融合蛋白分泌至大肠杆菌的周至内从而获得可溶性表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孔毅荣，于海双，李小红，
申请(专利权)人：北京嘉万生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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