制备多潜能干细胞的组合物、方法、试剂盒及其用途技术

本发明专利技术提供一种高效稳定制备高度免疫缺陷哺乳动物(如小鼠)多潜能干细胞的组合物、使用所述组合物的方法、包含所述组合物的试剂盒及其用途，所述组合物包含：干细胞基础培养基；和维生素C或其衍生物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供一种高效稳定制备高度免疫缺陷哺乳动物（如小鼠）多潜能干细胞的 组合物、方法、试剂盒及其用途。
技术介绍
为了提高对人体造血发生、固有免疫、传染性疾病、癌症和再生医学的理解和 认识，干细胞领域一直W来致力于开发人源化小鼠模型度enteetal.，2005;Kinget al.,2008;Kumaretal.,2008;Sunetal.,2007;化jimaetal.,2009)。近些年来，在 开发人源化小鼠方面取得了许多重要实验进展，其中之一是建立了高度免疫缺陷NOD-scid I12rg-/-(NPG)小鼠模型，运种小鼠模型具有严重免疫缺陷（theseverecombined immunodeficien巧，SCID)W及inte;rleukin-2Rg(Il-2Rg)等位基因缺失等特征（Itoet al.，2002)。NPG小鼠具有的非肥胖型糖尿病免疫缺陷的遗传背景导致树突状细胞功能和 巨嗜细胞功能受损W致于固有免疫发生缺陷（Shultzetal.，1995)，同时Prkdc基因编码 产生作为在T细胞和B细胞成熟过程中调控V值)J重组的关键蛋白，在NPG小鼠上也发生 了基因突变，导致消除了获得性免疫功能度luntetal.，1995)。此外，II化g-/-定点突 变完全删除了参与调控免疫功能过程的白介素2受体gamma链（interle址in2rec巧tor gammachain)，使得小鼠体内参与调控异体移植人类细胞的过程的NK细胞极度缺失（Cao etal. ,1995)。基于此，运些免疫缺陷优势使得NPG小鼠成为在体内研究人类细胞、组织、 器官的极好的受体模型，尤其是在建立为研究人体生物学和应用于临床前研究的提供重要 线索的人源化小鼠模型方面更是发挥了重要作用值evoyetal.，2012;Kooetal.，2009 ; Satoetal. , 2011)〇 尽管NPG小鼠是高度免疫缺陷，并且NPG小鼠人源化在体内研究人类疾病被证明 是非常有价值的动物模型，但是依旧存在一些明显的缺点阻碍了其未来广泛应用于建立人 源化小鼠模型。例如，NPG小鼠的胸腺内缺乏筛选T细胞的合适的血1C分子，W及一些提高 人体细胞存活和生长的人特异的生长因子。此外，NPG小鼠呈现低水平的和多变的T细胞 依赖抗体反应（Shultzetal.，2007)。W上运些缺点可能会阻碍其进一步应用到建立人源 化小鼠模型等领域。 然而，最近一个研究小组报道了在NPG小鼠中获得了人胚胎干细胞来源的功能 性胸腺类器官，为研究移植后人T细胞的成熟过程提供了有价值的线索和思路（Sunet al.，2013)。此外，另一种开发更合适的人源化小鼠的策略是向NPG小鼠的基因组中导 入编码人类特异的HLA和调控移植后T细胞筛选和存活的生长因子的基因（Shultzet al.，2007)。然而，运种策略的实施依赖于体外从NPG小鼠中建立多潜能干细胞。因此体外 建立稳定的NPG小鼠多潜能干细胞系正是一个非常好的研究切入点。
技术实现思路
本专利技术提供了一种体外高效稳定建立高度免疫缺陷NPG小鼠多潜能干细胞的方 法，该方法通过小分子筛选平台，确立了一种在传统2i/LIF培养条件基础上添加Vitamin C的培养条件，从而使在传统2i/LIF培养条件下不能体外稳定培养的高度免疫缺陷NPG小 鼠多潜能干细胞得到稳定长期培养。根据本专利技术，首先将NPG小鼠囊胚进行分离，并接种于 小鼠成纤维饲养层细胞上，在传统2i/LIF培养条件下或2i/LIF+VitaminC条件下培养5-8 天，然后用膜酶或accutase消化成单细胞传代。传代后使用2i/LIF+VitaminC进行长期 培养或传代。运种方法成功建系效率可高达50% (从28枚NPG小鼠囊胚中获得14株多潜 能干细胞系）。 运种方法建立的高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞系具有小鼠多潜能干细胞的所 有典型特征并且携带NPG小鼠特征性的基因突变。因此，本专利技术建立了一种体外高效稳定 建立高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞的方法，为未来开发全新的更优质的人源化小鼠模型 提供了稳定的操作平台。 更具体地，本专利技术提供W下各项：[000引 1. 一种用于制备哺乳动物的多潜能干细胞的组合物，所述组合物包含：干细胞基 础培养基；和维生素C或其衍生物，其中 (1)优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠，最优选是 选自W下品系小鼠组成的组的免疫缺陷小鼠：NOD-scid (NPG)，N0D-scid，B2m/ ，NOD-sci地2m/，Tg(HLA-A2)，N孤-scidTg(HLA-A2)，BALB/c-Rag2 /I12rg/，Ragl/，NOD -scidIL2rg/，化化g/，NOD-Ragl/II化g/，NOD-Ragl/，PWl/，NOD-Ragl/Prfl/，Tg (S0D1-G93A) IGur, Dmcfdx 5cv, NOD-Ragl / Tg(S孤1-G93A) 1加r, NOD-Ragl / Ins2Akita, ins2Aki ta，NOD-Ragl / Dmcfdx scv. (2)优选所述干细胞基础培养基是传统2i/LIF培养条件下使用的培养基，更优选 包含选自W下组成的组的干细胞培养基：D/F12,K-DMEM，KSR，FBS，N2,B27和它们的组合； 和/或(3)优选所述组合物包含选自由W下表示的维生素C或其衍生物： 2.根据W上1所述的组合物，其中所述组合物包含另外的信号通路调控因子或 联合另外的信号通路调控因子使用，优选所述信号通路调控因子选自WNT信号通路调控因 子、LIF/STAT3通路调控因子、MAPK通路抑制因子、维生素C相关下游信号通路调控因子和 它们的组合，优选GSK3-beta抑制剂或MAPK抑制剂，优选所述调控因子是作用于上述信号 通路的细胞因子、化学小分子、转录因子或胞外基质。 3.根据W上2所述的组合物，其中所述组合物包含：knock-outDMEM+N2(l〇〇x)/ B27巧Ox)，双抗（青霉素/链霉素），P-琉基乙醇，谷氨酷胺，非必需氨基酸 (Non-essentialAminoAcids)，CHIR99021，PD0325901，LIF和维生素C。 4. 一种用于制备哺乳动物的多潜能干细胞的试剂盒，所述试剂盒包含根据W上 1-3中任一项所述的组合物，任选地还包含另外的干细胞诱导因子，优选所述哺乳动物是免 疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠。 5. -种用于制备哺乳动物的多潜能干细胞的方法，所述方法包括在根据W上1-3 中任一项所述的组合物的存在下培养初始哺乳动物细胞，优选所述初始哺乳动物细胞是哺 乳动物早期胚胎（囊胚）建立的胚胎干细胞或适合于通过重编程技术获得多潜能干细胞的 体细胞，其中对于体细胞而言，在通过重编程技术获得多潜能干细胞的后期使用所述方法， 优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠；优选所述培养是在有饲 养层体系或无饲养层体系下培养。 6.通过根据W上5所述的方法获得的哺乳动物多潜能干细胞，优选所述哺乳动物 是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠，最优选NPG小鼠，优选所述多潜能干细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备哺乳动物的多潜能干细胞的组合物，所述组合物包含：干细胞基础培养基；和维生素C或其衍生物，其中(1)优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠，最优选是选自以下品系小鼠组成的组的免疫缺陷小鼠：NOD‑scid Il2rg–/–(NPG)，NOD‑scid,B2m‑/‑,NOD‑scidB2m‑/‑,Tg(HLA‑A2),NOD‑scidTg(HLA‑A2),BALB/c‑Rag2‑/‑Il2rg‑/‑,Rag1‑/‑,NOD‑scid IL2rg‑/‑,IL2rg‑/‑,NOD‑Rag1‑/‑Il2rg‑/‑，NOD‑Rag1‑/‑,Prf1‑/‑,NOD‑Rag1‑/‑Prf1‑/‑,Tg(SOD1‑G93A)1Gur,Dmdmdx‑5Cv,NOD‑Rag1‑/‑Tg(SOD1‑G93A)1Gur,NOD‑Rag1‑/‑Ins2Akita,Ins2Akita,NOD‑Rag1‑/‑Dmdmdx‑5Cv；(2)优选所述干细胞基础培养基是传统2i/LIF培养条件下使用的培养基，更优选包含选自以下组成的组的干细胞培养基：D/F12，K‑DMEM,KSR,FBS，N2，B27和它们的组合；和/或(3)优选所述组合物包含选自由以下表示的维生素C或其衍生物：...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓宏魁，刘康，方日国，李海波，苗振川，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：北京大学，北京维通达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11