本发明专利技术提供一种能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒，该质粒含有四个shRNA表达基因，能同时编码四种分别靶向流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因保守区域的特异shRNA。该质粒适用于多种转基因技术。使用慢病毒载体将该质粒转入体外培育的MDCK细胞后，经攻毒实验证明，筛选得到的转基因细胞系具有抵抗不同亚型流感病毒感染的能力。将该质粒通过静脉与肌肉注射入4周龄仔猪，然后用H3N2亚型猪流感病毒感染，发现经血液注射组具有更强的抑制流感病毒的复制。为RNAi应用于猪流感病毒的研究以及猪流感的防治积累了必要的实验数据，为转基因猪抗流感研究奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于遗传工程
，具体地说，设及一种能抑制猪流感病毒的ShRNA 转基因重组质粒及其应用。
技术介绍
猪流感（Swine Influenza, SI)是由正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒 (Influenza A virus, IAV)引起的一种急性、高度接触传染的呼吸道疾病，临床症状表现 为，发热、咳嗽、流鼻涕，结膜炎、厌食及精神不振等。猪流感病毒（Swine Influenza Virus， SIV)能在猪上呼吸道上皮细胞内复制，造成猪感染，致使猪体免疫系统稳态发生变化，导致 细菌、支原体和其他病毒的继发或混合感染，使疫情加重，病猪死亡率上升，给养猪业带来 极大经济损失。越来越多的资料表明，猪作为流感病毒的"混合器"，在流感病毒跨种属障碍 感染新宿主的过程中，起着重要的作用。猪上皮细胞具有唾液酸a-2, 6半乳糖巧和唾液酸 a -2, 3半乳糖巧，人流感病毒可与前者结合，而禽流感病毒与后者结合，由此决定了能够同 时被人流感病毒和禽流感病毒感染，使其成为IAV发生基因重组或重排的主要场所。猪流 感HA受体结合位点具有与两种流感病毒受体相同的结合特异性，是SIV不仅可感染猪，同 时也具有感染禽和人类的能力。因此，猪流感除了具有兽医公共卫生意义外，还具有深远的 人类公共卫生意义。 RNA干扰（RNA interference, RNAi)是指RNA对基因表达的调控，由 dsRNA (double-strand RNA)或 siRNA (small inte;rfe;ring RNA，siRNA)引发的对同源性 mRNA降解的现象。它最大优点在于具有高度的有效性和特异性，且具有快速的预防与治疗 效果。它的作用在基因功能研究和病毒性疾病的治疗领域有非常广阔的前景，例如在抗艾 滋病毒化IV)、乙型肝炎病毒化BV)、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus)等病毒病的研究中都发 现，RNAi对于抑制运些病毒的复制具有较好的效果，可能是运类病毒病治疗的有效途径。 A型流感病毒（IAV)属于正粘病毒科，是单股负链RNA病毒，W变异速度快、感染致 病性强、传播速度快成为造成人、哺乳动物和禽类流感大流行的主要病毒。目前抗病毒药物 和疫苗免疫存在局限性，使病毒对药物产生耐受性，迫于选择压力病毒会快速发生变异W 逃避药物或疫苗免疫；研究人员选择RNAi方法抑制流感病毒的复制通常针对流感病毒基 因的保守序列作为祀序列，由于干扰序列的高度转移性，使RNAi技术在流感病毒防治的应 用中也遇到了技术屏障。因此，亟需开发一种基于RNAi技术的抗病毒治疗新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能抑制猪流感病毒的ShRNA转基因重组质粒及其应用。 为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种能抑制猪流感病毒复制与感染的 shRNA,所述shRNA是W猪流感病毒PB2, W及任选PA、PB1、NP中的至少两种为祀基因，编码 所述shRNA的核巧酸序列为（如SEQ ID No. 1-8所示的核巧酸序列）： 具体的，在本专利技术的一种实施方式中，shRNA W猪流感病毒PB2、PA、PB1和NP为祀 基因； 在本专利技术的一种实施方式中，shRNA W猪流感病毒PB2、PA和PB1为祀基因； 在本专利技术的一种实施方式中，shRNA W猪流感病毒PB2、PA和NP为祀基因； 在本专利技术的一种实施方式中，shRNA W猪流感病毒PB2、PB1和NP为祀基因。 本专利技术还提供一种能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒，所述质粒共含有 =个或四个shRNA表达盒，即含有W猪流感病毒PB2为祀基因的shRNA表达盒，W及任选猪 流感病毒PA、PB1、NP中的至少两种为祀基因的shRNA表达盒。 其中，W猪流感病毒PA为祀基因的shRNA表达盒在h7SK启动子控制下，W猪流 感病毒PB1为祀基因的shRNA表达盒在hHl启动子控制下，W猪流感病毒PB2为祀基因的 shRNA表达盒在WJ6启动子控制下，W猪流感病毒NP为祀基因的shRNA表达盒在mU6启动 子控制下，且各表达盒呈串联状态。 上述RNA聚合酶III型启动子h7SK、抽1、WJ6和mU6使各shRNA表达盒在真核细 胞中稳定持续表达。每个启动子具有精确的碱基启动位点和终止信号，可W保证ShRNA最 高效地被启动转录， 前述重组质粒的出发质粒为pGenesil-EGFP。 前述出发质粒中含有嚷岭霉素抗性基因。 将本专利技术构建的重组质粒分别记为口66116311-口4斗81斗82、口66116311-PA-PB1-NP、pGenesil - PA-PB2-NP、pGenesil - PB1-PB2-NP与pGenesil - PA-PB1-PB2-NP， 它们分别含有S个或四个ShRNA表达基因，能同时编码S种或四种猪流感病毒基因组PA、 PB1、PB2与NP基因保守区域的特异shRNA。 本专利技术还提供含有编码前述能抑制猪流感病毒复制与感染的shRNA的DM的转基 因细胞、宿主及工程菌。 本专利技术还提供含有前述重组质粒的转基因细胞、宿主细胞及工程菌。 本专利技术所述的细胞为真核细胞，来自人、哺乳动物和/或禽类。 本专利技术还提供所述重组质粒在转基因育种中的应用。 所述应用是将所述重组质粒转入哺乳动物，使转基因动物后代抵抗流感病毒感 染，提高抗病能力。 本专利技术进一步提供所述重组质粒在抑制猪流感病毒复制与感染中的应用。所述重 组质粒可W应用于制备抑制猪流感病毒复制与感染的药物组合物。 所述应用是将所述重组质粒经静脉注射或肌肉注射到哺乳动物体内，使动物能抵 抗流感病毒感染，提高抗病能力。优选地，所述哺乳动物为猪。 本专利技术将shRNA表达盒通过酶切构建到慢病毒表达载体，获得复制缺陷性慢 病毒，分别命名为 pLV-EGFP-shPAPBlPB2、pLV-EGFP-shNPAPBl、pLV-EGFP-shNPAPB2、 pLV-EGFP-shNPBlPB2与pLV-EGFP-shNPAPBlPB2。经重组慢病毒滴度检测确定慢病毒滴度。 用所述复制缺陷型慢病毒感染MDCK细胞，2yg/血嚷岭霉素抗性筛选，建立整 合有目的基因的细胞系，分别命名为shPAPBlPB2-MDCK、shNPAPBl-MDCK、shNPAPB2-MDCK、 shNPBlPB2-MDCK、shNPAPBlPB2-MDCK 与 Mock-MDCK。 本专利技术采取了多基因干扰ShRNA基因串联构建到一个质粒载体上的策略，并且对 =基因与四基因串联进行比较，首次证明了四基因串联质粒载体对H1N1猪流感病毒的抑 制作用高于=基因，多基因干扰ShRNA在H1N1猪流感病毒复制周期中发挥更强的抑制作 用。 经攻毒实验首次证明，表达四基因shNPAPBlPB2-MDCK细胞系不仅能抵抗化N1亚 型猪流感病毒，还能抵抗H3N2亚型猪流感病毒，此外，还能抵抗册N1亚型禽流感病毒，具有 对不同毒株交叉抑制的潜力。 本专利技术通过静脉注射与肌肉注射两种方式接种ShRNA表达载体，比较两种给药途 径研究shRNA对H3N2亚型猪流感病毒的抑制作用，结果首次证明静脉注射的shRNA有更好 地抑制H3N2亚型猪流感病毒的作用。 本专利技术构建的能抑制猪流感病本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能抑制猪流感病毒复制与感染的shRNA，其特征在于，所述shRNA是以猪流感病毒PB2，以及任选PA、PB1、NP中的至少两种为靶基因，编码所述shRNA的核苷酸序列为：PB2‑1154 up‑5’‑CACCTGTCGCTTTGAAAGTGAAATTCAAGACGTTTCACTTTCAAAGCGACATTTTTTG‑3’ low‑5’‑AGCTCAAAAAATGTCGCTTTGAAAGTGAAACGTCTTGAATTTCACTTTCAAAGCGACA‑3’；NP‑1496 up‑5’‑TTTGGCTACAGATCACTTTACCTTTCAAGACGAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTTTTTG‑3’ low‑5’‑AGCTCAAAAAAGCTACAGATCACTTTACCTCGTCTTGAAAGGTAAAGTGATCTGTAGC‑3’；PA‑2087 up‑5’‑CCTCGAGTACCGGCGTCTCTTTGTTCAAGACGCAAAGAGACGCCGGTACTCTTTTTTG‑3’ low‑5’‑AGCTCAAAAAAGAGTACCGGCGTCTCTTTGCGTCTTGAACAAAGAGACGCCGGTACTC‑3’；和/或PB‑2257 up‑5’‑TCCCCCAGATGCAGGAGGACATGTTCAAGACGCATGTCCTCCTGCATCTGGTTTTTTG‑3’ low‑5’‑AGCTCAAAAAACCAGATGCAGGAGGACATGCGTCTTGAACATGTCCTCCTGCATCTGG‑3’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆文，王伟，陈洪岩，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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