作为治疗试剂的Gla结构域制造技术

本公开内容涉及重组Gla结构域蛋白质，及其靶向细胞表面上的磷脂酰丝氨酸（PtdS）部分的用途，所述细胞特别是表达升高水平的PtdS的那些，例如经历细胞凋亡的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】背景本申请要求于2013年3月15日提交的美国临时申请序列号61/791,537，和2013年3月15日提交的美国临时申请序列号61/787,753的优先权利益，所述美国临时申请的整个内容在此引入作为参考。1. 领域本公开内容涉及使用Gla结构域肽和多肽靶向细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PtdS）。公开了这些肽和多肽作为治疗试剂的用途。2. 相关技术磷脂酰丝氨酸（PtdS）是通常定位于细胞膜的内叶（细胞质侧）的带负电的磷脂组分。然而，PtdS可以通过混杂酶（翻转酶家族成员）从内叶转运到外叶，并且暴露于细胞表面上。除了极少数例外，PtdS的这种活性外化是对细胞损害的应答（van den Eijnde等人，2001；Erwig和Henson, 2008）。例如，组织损伤给血小板、白细胞和内皮细胞发信号，以快速且可逆地重新分配PtdS，这导致促进在细胞表面上的凝血和补体活化。类似地，细胞凋亡信号导致PtdS的外化，然而，以更逐步和持续的方式。这种外部PtdS提供了关键识别标记物，其允许巨噬细胞摄取来自周围组织的濒死细胞，同时压制完全和有害的免疫应答（Erwig和Henson, 2008）。这种去除过程是组织稳态必需的，并且在“健康”环境中，它是非常有效的。事实上，尽管每天丧失>109细胞，但凋亡细胞的组织学检测在正常组织中是罕见事件（Elltiot和Ravichandran, 2010；Elltiot等人，2009）。然而，在许多病理学状况下，存在凋亡细胞去除的过程不堪重负、延迟或不存在的证据（Elltiot和Ravichandran, 2010；Lahorte等人，2004）。例如，几项肿瘤学研究提出高细胞凋亡指数与更高级别的肿瘤、增加的迁移率和患者的预后不良相关（Naresh等人，2001；Loose等人，2007；Kurihara等人，2008；Kietselaer等人，2002）。这些研究以及类似这些的其他研究提出细胞凋亡和外部PtdS表达可以是有力的疾病标记物（Elltiot和Ravichandran, 2010）。存在对于阴离子磷脂表面具有高亲和力的几种蛋白质，其中膜联蛋白V最广泛用作PtdS靶向探针（Lahorte等人，2004）。对于含PtdS囊泡具有高亲和力（Kd = 0.5-7 nM）和低于肾滤过阈值（大约60 kDa）的分子量（37 kDa），膜联蛋白V在临床中已显示作为细胞凋亡探针的希望（Lin等人，2010；Tait和Gibson, 1992）。此外，它已用于广泛多样的适应症，包括肿瘤学、神经病学和心脏病学中的那些（Lahorte等人，2004；Boersma等人，2005；Blankenberg, 2009；Reutelingsperger等人，2002）。靶向PtdS细胞表面表达的生物探针的使用已在体外和在体内显示。虽然它们在临床中的效用是有希望的，但它们在很大程度上仍未被利用。概述因此，依照本公开内容，提供了靶向细胞膜磷脂酰丝氨酸（PtdS）的方法，其包括（a）提供包含γ羧基谷氨酸（Gla）结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域的经分离的多肽；和（b）使肽与细胞表面接触，其中所述多肽与细胞膜上的PtdS结合。细胞膜可以是心肌细胞膜、神经元细胞膜、内皮细胞膜、病毒感染细胞膜、凋亡细胞膜、血小板膜、质膜衍生的囊泡（PMV）或癌细胞膜。多肽可以进一步包含EGF结合结构域、Kringle结构域和/或芳香族氨基酸堆叠结构域。Gla结构域可以来自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白S或蛋白C。多肽可以进一步包含可检测标记，例如荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶、染料或配体。多肽可以为300个残基或更少、200个残基或更少、或100个残基或更少，包括100-200和100-300个残基的范围。多肽可以包含5-15个Gla残基，9-13个Gla残基，包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个Gla残基。多肽可以包含超过13个Gla残基，但小于30%的总Gla残基。多肽可以大小为约4.5至30 kD。多肽可以包含至少一个二硫键或2-5个二硫键。多肽可以包含蛋白S Gla结构域。多肽可以包含蛋白S Gla结构域、蛋白S EGF结构域、凝血酶原Gla结构域、凝血酶原Gla结构域加上凝血酶原Kringle结构域、蛋白Z Gla结构域、蛋白Z Gla结构域加上凝血酶原Kringle结构域、因子VII Gla结构域、或因子VII Gla结构域加上凝血酶原Kringle结构域。多肽可以进一步包含抗体Fc区。前述中的任一种均可含有前述蛋白质的天然序列的保守置换，和/或显示出与所示天然结构域的同源性百分比。在另一个实施方案中，提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括给受试者施用经分离的多肽，其包含γ羧基谷氨酸（Gla）结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域。癌症可以是乳腺癌、脑癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、结肠癌、皮肤癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、肝癌、胰腺癌、头与颈癌或食道癌。该方法可以进一步包括用第二癌症疗法治疗受试者，所述第二癌症疗法例如免疫疗法、放射疗法、化学疗法、毒素疗法、细胞因子疗法或激素疗法。另外一个实施方案包括治疗受试者中的自身免疫疾病的方法，其包括给受试者施用经分离的多肽，其包含γ羧基谷氨酸（Gla）结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域。自身免疫疾病可以是脊椎关节病、强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、肠病性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肠易激病、炎性肠病、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、家族性地中海热、肌萎缩侧索硬化、干燥综合征、早期关节炎、病毒性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、牛皮癣、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿、阿狄森氏病、脱发、抗磷脂综合征、白塞氏病、乳糜泻、慢性疲劳综合症、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、纤维肌痛、自身免疫性胃炎、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯氏病、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、重症肌无力、寻常型天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、风湿热、肉瘤样病、硬皮病、白癜风、血管炎、小血管炎、肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉瘤样病、硬皮病、移植物抗宿主病（急性和慢性）、再生障碍性贫血、或周期性嗜中性粒细胞减少症。该方法可以进一步包括用第二自身免疫疾病疗法治疗受试者，所述第二自身免疫疾病疗法例如强的松、甲基强的松、Venipred、倍氟米松、氢化可的松、去炎松、关节内注射己曲安奈德、Methapred、口服Rayos、倍他米松或依那西普。在另外一个实施方案中，提供了治疗受试者中的病毒疾病的方法，其包括给受试者施用经分离的多肽，其包含γ羧基谷氨酸（Gla）结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域。病毒疾病可以是流感、人类免疫缺陷病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、天花病毒、呼吸道合胞病毒、朝鲜出血热病毒、水痘、水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒1或2、EB病毒、马尔堡病毒、汉坦病毒、黄热病病毒、甲、乙、丙或戊型肝炎、埃博拉病毒、人乳头状瘤病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒、轮状病毒、HTLV-1和-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向细胞膜磷脂酰丝氨酸（PtdS）的方法，其包括：（a）提供包含γ羧基谷氨酸（Gla）结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域的经分离的多肽；和（b）使所述肽与细胞表面接触，其中所述多肽与所述细胞膜上的PtdS结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.15 US 61/787753;2013.03.15 US 61/7915371.一种靶向细胞膜磷脂酰丝氨酸（PtdS）的方法，其包括：
（a）提供包含γ羧基谷氨酸（Gla）结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域的经分离的多肽；和
（b）使所述肽与细胞表面接触，
其中所述多肽与所述细胞膜上的PtdS结合。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞膜是心肌细胞膜、神经元细胞膜、内皮细胞膜、病毒感染细胞膜、凋亡细胞膜、血小板膜或癌细胞膜。
3.权利要求1的方法，其中所述多肽进一步包含EGF结合结构域。
4.权利要求1的方法，其中所述多肽进一步包含Kringle结构域。
5.权利要求1的方法，其中所述多肽进一步包含芳香族氨基酸堆叠结构域。
6.权利要求1的方法，其中所述Gla结构域是来自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白S或蛋白C的Gla结构域。
7.权利要求1的方法，其中所述多肽进一步包含可检测标记。
8.权利要求7的方法，其中所述可检测标记是荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶、染料或配体。
9.权利要求1的方法，其中所述多肽是300个残基或更少。
10.权利要求1的方法，其中所述多肽是200个残基或更少。
11.权利要求1的方法，其中所述多肽是100个残基或更少。
12.权利要求1的方法，其中所述多肽包含5-15个Gla残基。
13.权利要求1的方法，其中所述多肽包含9-13个Gla残基。
14.权利要求1的方法，其中所述多肽包含超过13个Gla残基，但小于30%的总Gla残基。
15.权利要求1的方法，其中所述多肽大小为约4.5至30 kD。
16.权利要求1的方法，其中所述多肽包含至少一个二硫键。
17.权利要求1的方法，其中所述多肽包含2-5个二硫键。
18.权利要求1的方法，其中所述多肽包含蛋白S Gla结构域。
19.权利要求1的方法，其中所述多肽包含蛋白S Gla结构域和蛋白S EGF结构域。
20.权利要求1的方法，其中所述多肽包含凝血酶原Gla结构域。
21.权利要求1的方法，其中所述多肽包含凝血酶原Gla结构域加上凝血酶原Kringle结构域。
22.权利要求1的方法，其中所述多肽包含蛋白Z Gla结构域。
23.权利要求1的方法，其中所述多肽包含蛋白Z Gla结构域加上凝血酶原Kringle结构域。
24.权利要求1的方法，其中所述多肽包含因子VII Gla结构域。
25.权利要求1的方法，其中所述多肽包含因子VII Gla结构域加上凝血酶原Kringle结构域。
26.权利要求1的方法，其中所述多肽进一步包含抗体Fc区。
27.一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括给所述受试者施用经分离的多肽，其包含γ羧基谷氨酸（Gla）结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域。
28.权利要求27的方法，其中所述癌症是乳腺癌、脑癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、结肠癌、皮肤癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、肝癌、胰腺癌、头与颈癌或食道癌。
29.权利要求27的方法，其进一步包括用第二癌症疗法治疗所述受试者。
30.权利要求28的方法，其中所述第二癌症疗法是免疫疗法、放射疗法、化学疗法、毒素疗法、细胞因子疗法或激素疗法。
31.一种治疗受试者中的自身免疫疾病的方法，其包括给所述受试者施用经分离的多肽，其包含γ羧基谷氨酸（Gla）结构域且缺乏蛋白酶或激素结合结构域。
32.权利要求31的方法，其中所述自身免疫疾病是脊椎关节病、强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、肠病性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肠易激病、炎性肠病、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节...

【专利技术属性】
技术研发人员：M鲍聪，T赫米斯顿，
申请(专利权)人：拜尔健康护理有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US