一种VEGF单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种VEGF单克隆抗体，所述抗体包括轻链和重链，其中轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.1，重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.2，本发明专利技术通过酶联免疫实验证实了所述抗体能够与VEGF特异性的结合。本发明专利技术所述的抗体能够有效检测VEGF，对其检测的灵敏度达0.6ng/ml。本发明专利技术所述的抗体能够用于制备检测VEGF的试剂盒和治疗相关疾病的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，具体而言涉及一种VEGF的单克隆抗体，本专利技术还涉及 所述抗体的制备方法与其在制备检测VEGF试剂盒中的应用。
技术介绍
单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗 体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础 上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B 细胞杂交瘤。应用于医疗中时，在识别抗原中的显示微小变化有助于减小副作用。单克隆 抗体具有三种独特的作用机制，分别为靶向效应、阻断效应和信号传导效应。 单克隆抗体药物发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆 抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。在第一个阶段中，鼠源单克隆抗体是用小鼠 制备的普通单克隆抗体药物，一方面抗体不能有效的激活人体中补体和FC受体相关的效 应系统，被人体免疫系统识别产生人抗鼠抗体（HAM)，在人体循环系统中很快被清除掉，另 一方面它毒副作用明显，常引起人体的不良反应，大大制约了其在临床实验及相关应用领 域的发展；第二代人鼠嵌合性单抗药物对小鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造，使其 人源化程度达到70%左右，仍有很大的毒副作用；而后出现的第三代人源化单抗的人源化 程度达到95%左右，更加接近于人体自身的抗体，大大降低了毒副作用。全人源抗体是从人 体免疫B细胞中直接分离，作为治疗性抗体基本没有排异反应，具有不可替代的优势。 单克隆抗体除了用于制备治疗药物，由于其与物质结合时特异的，所以单克隆抗 体还可用于制备检测试剂。 人血管内皮生长因子（VEGF)是正常和异常血管新生的重要调节因子，在生理和 病理性血管新生中起重要作用。其主要作用机制是作为一种促内皮细胞分裂素，促进血管 内皮细胞分裂、增殖以及血管生成。VEGF参与了肿瘤发生和发展整个过程，肿瘤组织快速生 长，导致营养供应不足，在缺氧状态下，肿瘤细胞表达VEGF显著增加，VEGF局部浓度的升高 可以促进新生血管的形成，促进肿瘤的发生发展。 VEGF家族成员共包括五个：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF， 分别由各自的基因编码。VEGF家族成员均与细胞膜酪氨酸受体相互作用，导致受 体二聚化和自身磷酸化，并启动信号级联反应，激活大量下游蛋白，如磷脂酰肌醇 3_ 激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)、Ras、有丝分裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)等，介导相应的生物学效应 VEGF-A通常被称为VEGF，因为VEGF-A是血管发生和祖内皮细胞分化的关键调节 剂，在人类多种肿瘤中，VEGF-A都是过表达的，这与肿瘤的增殖、侵袭和转移呈正相关。 研究表明，食管癌患者血浆中VEGF与TGF-P1的表达水平明显高于正常人的表达 水平，提示血浆中VEGF与TGF-P1可能参与了食管癌的发生。VEGF与TGF-P1的表达水平 可以作为食管癌早期检测的指标。还有研究表明VEGF蛋白在前列腺癌组织中有显著的高 表达，且与临床分期、骨转移密切相关。 鉴于此，本领域需要一种准确检测VEGF表达水平的试剂，用于各类与VEGF高表达 的疾病的早期诊断。为解决上述问题本专利技术人通过杂交瘤技术筛选到了特异性强、灵敏度 高的抗体。
技术实现思路
由于VEGF在众多肿瘤疾病中高表达，为此开发一种能准确检测VEGF表达水平的 试剂，对于用于各类与VEGF高表达的疾病的诊断具有重要的临床意义。为此本专利技术通过杂 交瘤技术筛选出了多株与VEGF特异性结合的单克隆抗体，其中编号为YS03的抗体株结合 效果最好。 本专利技术公开了一种抗人VEGF的单克隆抗体YS03,所述单克隆抗体包括轻链和重 链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示。 本专利技术所述的单克隆抗体YS03的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、 CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5所示。 所述单克隆抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分 别如序列表中SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 所示。 本专利技术还公开了上述单克隆抗体YS03的制备方法，主要包括如下： 1.抗人VEGF单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建 首先，原核表达人VEGF蛋白，免疫Balb/c小鼠，用常规方法进行细胞融合。用间 接ELISA法筛选阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100% 阳性。 2.杂交瘤细胞抗体轻、重链基因的钓取 提取单克隆抗体YS03细胞的RNA，经RT-PCR，用特异性引物钓取抗体的轻重链基 因。常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行 DNA测序分析。 3.单克隆抗体YS03可变区氨基酸序列和互补决定区氨基酸序列的分析 用www.expasy.org在线软件将单克隆抗体YS03的轻、重链可变区核苷酸序列翻 译为其编码的氨基酸序列，单克隆抗体YS03的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:1 和SEQIDNO:2 所示； 根据Kabat数据库确定单克隆抗体YS03轻链可变区序列中的互补决定区⑶RU CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所 示；重链可变区序列中的互补决定区⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ IDNO:6、SEQIDNO:7 和SEQIDNO:8 所示； 本专利技术的单克隆抗体基于上述已克隆到的人VEGF结合性单克隆抗体YS03轻、重 链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、 Fab抗体、抗体融合蛋白等；基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活 性分子，制备用于VEGF表达水平检测、诊断和治疗VEGF高表达所导致疾病的诊断或治疗药 物。 本专利技术基于YS03抗体构建了用于检测VEGF的ELISA试剂盒，所述的ELISA试剂 盒包括：抗VEGF抗体YS03、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋 白标准品人VEGF(100ug/ml，0.Iml)、阴性对照样品BSA。 本专利技术还对单克隆抗体YS03的灵敏性进行了检测，结果显示本专利技术的试剂盒能 够灵敏的检测样品中VEGF的含量，其灵敏度能够达到0. 6ng/ml。 本专利技术的所述的YS03抗体或其片段也可连接化学物部分。这些化学物部分可以 是多聚物、荧光标记物、细胞毒性因子、放射性核素等。化学物部分优选可提供抗体在体内 半衰期的多聚物。适合的多聚物包括（但不限于）聚乙二醇、右旋糖酐和单甲基聚乙二醇。 本专利技术抗体和抗体片段可以连接荧光或化学发光标记物，如荧光团如稀土螯合 物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、水母发光蛋白标记物、 生物素/亲和素、旋光标记物和稳定自由基。 本专利技术抗体和抗体片段分子也可交联细胞毒性因子，例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种VEGF单克隆抗体及其片段，包括轻链CDR1‑3和重链CDR1‑3，其特征在于，所述轻链CDR1‑3的氨基酸序列为：CDR1：如序列表中SEQ ID NO：3所示；CDR2：如序列表中SEQ ID NO：4所示；CDR3：如序列表中SEQ ID NO：5所示；所述重链CDR1‑3的氨基酸序列为：CDR1：如序列表中SEQ ID NO：6所示；CDR2：如序列表中SEQ ID NO：7所示；CDR3：如序列表中SEQ ID NO：8所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙耀兰，杨承刚，
申请(专利权)人：北京泱深生物信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11