本发明专利技术涉及一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)Liu-g1(CGMCC No.10790)活菌制剂的制备方法，适用于畜禽水产养殖业中饲用功能性活菌制剂的生产。本发明专利技术利用筛选自传统干酪的一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1菌株，经过活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩和冷冻干燥等工序制备成高活菌数的活菌制剂。本发明专利技术通过对发酵培养基和发酵条件的优化，利用全自动发酵罐发酵使Liu-g1菌株的活菌数量可达9.0×109CFU/mL以上，冻干后活菌制剂的活菌数量可达1011CFU/g以上。本发明专利技术制备的活菌制剂价格低廉，活菌含量高，可作为禽畜饲料生物添加剂及微生态制剂，具有提高动物生长速度、节省饲料用量、减少发病率、降低饲养成本等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种产中性蛋白酶的凝结芽抱杆菌Liu-gl活菌制剂的制备方法，适 用于畜禽养殖业功能性微生态制剂的生产。
技术介绍
饲用微生态制剂是采用农业部认可的动物肠道有益微生物经发酵、纯化、干燥而 精制的复合生物制剂，是一种减少或替代抗生素使用的绿色生物添加剂。 1989年，美国食品与药物管理局（抑A)和美国饲料控制官员协会公布了可W直 接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种名单共42种，其中包括凝结芽抱杆菌度acillus coagulans)。我国农业部《饲料添加剂品种目录（2013)》发布的饲料添加剂包括凝结芽抱 杆菌，可饲喂肉鸡、生长育肥猪和水产养殖动物。凝结芽抱杆菌为兼性厌氧菌，在有氧条件 下有利于繁殖菌体，在无氧条件下产生大量乳酸。该菌既具有乳酸菌产乳酸的特性，又具有 良好的抗逆性。其芽抱对高溫及低抑环境具有很强的耐受性，可顺利通过胃肠道逆环境， 并发挥良好的益生效果，因此可用于制备微生态制剂。 凝结芽抱杆菌可发酵葡萄糖、薦糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、海藻糖产酸而不产 气。该菌具有丰富的能够水解大分子物质的胞外酶系，可产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及纤 维素酶等活性物质，有助于增强胃肠道对食物的消化与吸收能力，提高饲料转化率，因此可 作为饲用微生态制剂而广泛应用于畜禽饲养中。此外，凝结芽抱杆菌还可产生P-半乳糖 巧酶与乳酸脱氨酶，因此有助于乳糖不耐受症人群对乳糖的消化。 本专利技术设及的产中性蛋白酶凝结芽抱杆菌Liu-gl可用于发酵生产活菌制剂。 经过本专利技术优化培养基配方与发酵条件后，活菌制剂中Liu-gl菌株的活菌数量可达到 l〇iiC即/gW上。将凝结芽抱杆菌Liu-gl活菌制剂添加到畜禽饲料中，可提高畜禽对饲料 中蛋白质的消化吸收。此外，试验研究表明，该菌还能分泌a-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等 酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类共同发挥作用，提高饲料利用率。 在制备凝结芽抱杆菌活菌制剂过程中，由于发酵培养基配方直接影响凝结芽抱杆 菌的活菌数量、发酵时间和生产成本，故优化发酵培养基的配方是本专利技术的关键技术。目前，国内申请凝结芽抱杆菌的专利较多，
技术实现思路
大多是凝结芽抱杆菌的菌种 检测技术和芽抱的制备方法，如专利技术专利CN1103160455A公开了 "凝结芽抱杆菌的芽抱制 剂的制备方法"，该专利报道采用半封闭式固体发酵工艺，生长后期氧气大量减少，刺激芽 抱快速形成；如专利技术专利CQ102304559A公开了 "凝结芽抱杆菌的巧光定量PCR快速检测 方法"，该专利报道了一种快速检测凝结芽抱杆菌的巧光定量PCR方法。 关于凝结芽抱杆菌发酵方面的专利：如专利技术专利CN103289910A公开了 "一种凝 结芽抱杆菌的固体发酵生产方法"，该专利报道了凝结芽抱杆菌的固体发酵生产方法，采用 凝结芽抱杆菌作为发酵菌种，在优化的固体培养基中，溫度为37~4(TC的条件下培养，经 过S级种子扩大培养而进行大规模发酵生产；如专利技术专利CN103911326A公开了 "凝结芽 抱杆菌益生菌制剂的制备"，该专利报道了一种凝结芽抱杆菌利用分段接种技术，混菌发酵 对菌种的生长、增殖具有互相促进作用，发酵后产品的色泽和口感等感官特征得到改善和 多样化，同时提高了营养物质降解率；如专利技术专利CN104232525A公开了"一种凝结芽抱杆 菌活菌制剂的制备工艺"，该专利报道了一种凝结芽抱杆菌活菌制剂的制备工艺，凝结芽抱 杆菌经一、二级种子扩大培养后接入发酵培养基中培养，在发酵过程中通过补料流加碳源 增加芽抱杆菌的数量和转化率，显著提高了产量，降低了成本。目前有关凝结芽抱杆菌快速检测、芽抱制备及其活菌制剂制备方法已见专利报 道。但是，关于利用产中性蛋白酶的凝结芽抱杆菌制备活菌制剂的方法尚未见国内外相关 文献报道和专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种产中性蛋白酶的凝结芽抱杆菌Liu-gl活菌制剂的制 备方法。 本专利技术是通过W下技术方案实现的： 本专利技术所设及的凝结芽抱杆菌度acillus coagulans)Liu-gl，分离筛选自传统干 酪中，已于2015年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称 CGMCC)，保藏号为：CGMCCNo.10790。在脑屯、浸液度HI)培养基上，凝结芽抱杆菌度acillus coagulans) Liu-gl的菌落大小为2~4mm，灰白色、不透明、表面湿润、边缘不整齐，菌落表 面初期（45°C，培养6~8h)扁平，后期皱權凸起；菌体细胞呈大杆状，长短不一，中生芽抱， G+好氧嗜热菌。 所述方法中，采用单因素多水平和正交试验对凝结芽抱杆菌Liu-gl发酵培养基 配方进行优化，优化后的发酵培养基配方为（质量体积比浓度，W/V) :1%玉米淀粉，1%大 豆巧，0. 2 %碳酸巧，蒸馈水1000血，pH7. 5。 所述方法中，在上述试验结果基础上，采用单因素多水平和正交试验进行凝结芽 抱杆菌Liu-gl发酵条件的优化。优化后的发酵条件为：发酵液初始抑7. 5,发酵时装液量 50血/250血S角瓶，接种量2%，发酵溫度45°C，摇床转速18化/min,发酵时间48h。所述方法中，将上述1L优化发酵培养基装入化自动发酵罐中进行高密度分批发 酵，接种量为2 %，控制发酵溫度45°C，发酵液初始抑7. 5,揽拌转速180~22化/min,发酵 时间48h，得到凝结芽抱杆菌Liu-gl发酵液。 上述方法中，5L自动发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为 BI0F6005GBN。 所述方法中，在上述试验结果基础上，利用立式高速冷冻离屯、机将1L发酵液于 4°C条件下，500化/min离屯、20min，弃上清液，收集得到菌泥。 所述方法中，立式高速冷冻离屯、机由湘仪离屯、机仪器有限公司提供，型号为 化-21M。 所述方法中，将收集的菌泥加入到发酵液原体积1/10的含有10. 5%麦芽糊精、 4%马铃馨淀粉和5. 5%乳清粉（质量体积比浓度，W/V)冻干保护剂中，混合均匀后，得到凝 结芽抱杆菌Liu-gl与冻干保护剂的混合物。 所述方法中，将上述混合物于-36°c低溫冰箱中预冻1化至完全冻结状态，得到预 冻活菌制剂。 所述方法中，利用化LABC0NC0真空冷冻干燥机（美国）将预冻活菌制剂于冻干 溫度-55°C、真空度0.ISmBar的条件下，冻干4化至完全干燥状态，得到产中性蛋白酶的凝 结芽抱杆菌Liu-gl冻干活菌制剂。 所述方法中，采用小试发酵生产技术和冻干工艺所得到的产蛋白酶凝结芽抱杆菌 Liu-gl活菌制剂的活菌数量可达到l〇iiC即/gW上，菌种存活率可达85%W上。 上述方法得到的产中性蛋白酶凝结芽抱杆菌Liu-gl活菌制剂的制备方法，W及 专用生产菌株属于本专利技术保护范围。【具体实施方式】 下述实施例对本专利技术作进一步说明而不限制本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。 实施例1、产中性蛋白酶的凝结芽抱杆菌Liu-gl活菌制剂的制备 [002引1、菌种活化 将凝结芽抱杆菌Liu-gl斜面或平板培养物接种于装有灭菌的5mLBHI培养基试 管中，于45°C转速为15化本文档来自技高网...
【技术保护点】
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)Liu‑g1CGMCC No.10790。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧，张红星，谢远红，郭茜，高秀芝，熊利霞，金君华，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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