分子成像和相关方法技术

本发明专利技术涉及单个分子成像，或单个分子的一个或多个集合，以及与成像相关的方法。在方法方面，本发明专利技术提供了单分子成像的方法。该方法包括以下步骤：a)将测试样品暴露给探针，其中所述探针包含特异结合至靶分子的第一部分，以及因与以一个或多个波长的光相互作用的一个或多个化学基团而可检测的第二部分，其中所述探针与靶分子结合，形成复合物；b)将复合物暴露给与所述一个或多个化学基团相互作用的光的一个或多个波长，及；c)与所述一个或多个化学基团相互作用的光，检测与其一个或多个波长相互作用而形成的结果，生成一个或多个单分子的影像。该影像在至少1×105平方微米的成像区域上具有高于450纳米的分辨率，且其中影像通过一个单一检测步骤便可得到，而无需改变任何检测设置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 本申请要求享有以下提交于2013年3月6日、编号61/851,276的美国临时专利 申请的权利，通过引用的方式包括在本申请中。
本专利技术涉及单个分子成像，或单个分子的一个或多个集合，以及与成像相关的方 法。
技术介绍
曾有报道介绍过以约300纳米的分辨率在极小的区域（即，小于lOnmxlOOnm的区 域）检测单个分子的方法。例如荧光原位杂交（FISH)是一种测量基因表达的方法，这种方 法足够敏感，可以检测单个mRNA分子。正如辛格最初的描述，该方法涉及五支寡核苷酸探 针对每个mRNA目标同时杂交。费米诺AM、费伊FS、福格蒂K、辛格RH。单个RNA原位转录 之可视化。《科学》。1998;280:585-590。所述寡核苷酸各长约50个核苷酸，且各标有多达 五个荧光团。于是在荧光显微镜下，mRNA目标在杂交时变为可见的衍射极限荧光斑点。 拉吉已经研制出了改良的FISH方法。见拉吉A、范登包革P、里夫金SA、范奥德 纳尔德A、特亚吉S。使用多个单标记探针使单个mRNA分子成像。《自然方法学》，2008 ;5 ; 877-879。该方法使用了大量单独标记探针代替数量有限但多重标记的探针，用于克服辛 格的原始FISH步骤所造成的若干问题：大量标记的寡核苷酸难以合成及纯化；当某些荧光 团以多份拷贝存在于同一寡核苷酸中时，发生自淬灭；信号易于变性。见费米诺AM、福格蒂 K、利弗席兹LM、卡林顿W、辛格RH。原位mRNA单个分子可视化。《酶学方法》。2003:361; 245-394。另见兰多夫JB、瓦格纳AS。多重标记的荧光DNA探针之稳定性、特异性和荧光亮 度。《核酸研究》。1997;25;2923-2929.拉吉改良后的方法能生成可被识别的均匀信号，提 供极小的视场中mRNA准确计数，而探针的产生和纯化比较简单。 尽管有辛格和拉吉等科学家开展的研究工作，在本领域仍存在改进分子成像和相 关方法的需要。
技术实现思路
在方法方面，本专利技术提供了单分子成像的方法。该方法包括以下步骤：a)将测试 样品暴露给探针，其中所述探针包含特异结合至靶分子的第一部分，以及因与以一个或多 个波长的光相互作用的一个或多个化学基团而可检测的第二部分，其中所述探针与靶分子 结合，形成复合物；b)将复合物暴露给与所述一个或多个化学基团相互作用的光的一个或 多个波长，及；c)与所述一个或多个化学基团相互作用的光，检测与其一个或多个波长相 互作用而形成的结果，生成一个或多个单分子的影像。该影像在至少IX 105平方微米的成 像区域上具有高于450纳米的分辨率，且其中影像通过一个单一检测步骤便可得到，而无 需改变任何检测设置。 在方法的另一方面，本专利技术提供了单分子成像的方法。该方法包括以下步骤：a) 将测试样品暴露给探针，其中所述探针包含特异结合至目标分子的第一部分，以及经过改 性而包含与一个或多个波长的光相互作用的一个或多个化学基团的第二部分，其中所述探 针与目标分子结合，形成复合物；b)将探针第二部分改性，使之包含与光相互作用的一个 或多个化学基团；c)将复合物暴露给与所述一个或多个化学基团相互作用的光的一个或 多个波长，及d)与所述一个或多个化学基团相互作用的光，检测与其一个或多个波长相互 作用而形成的结果，生成一个或多个单分子的影像。该影像在至少IX 105平方微米的成像 区域上具有高于450纳米的分辨率，且其中影像通过一个单一检测步骤便可得到，而无需 改变任何检测设置。【附图说明】 图1示出了 SA0成像装置的一种实施例。 图2A示出了SA0成像装置的另一种实施例。 图2B示出了根据一个实施例的SA0成像装置光照模式产生模块的内部结构。 图2C示出了根据另一种实施例的SA0成像装置光照模式产生模块的内部结构。 图3示出了 SA0 -般方法。 图4不出了视场直径26mm光学显微镜的视场直径和面积表。 图5示出了光波长对固定数值孔径（0. 95)分辨率的影响表。 图6不出了使用标准焚光显微镜为一个mRNA或若干mRNA成像的一种方法以及本 专利技术介绍的使用包含有SA0成像装置为一个mRNA或若干mRNA成像的相反方法。 图7显示了TOPI mRNA(亮/白/绿点）SA0图像的一部分，图像区域含有大约100 个细胞。 图8显示了 TOP 1 mRNA之SA0图像感兴趣区之选择，包括有基于斑点强度和质量 的选择过程。 图9显示了 MCF7人乳腺癌细胞系HER2mRNA(亮/白点）相关的SA0图像。图中 显示了含有超过1〇〇个细胞的图像区域，并伴有成像细胞截面图像，含有约20个细胞。就 所述20个细胞之图像，根据所示情况，平均每个细胞包括约72份HER2mRNA。 图10显示了标准荧光显微镜（60倍/l. 41NA0. 1油）下来自A549细胞的 FKBP5mRNA两份相关图像（亮/白点）。标有"减地塞米松"的图像显示了加入24纳米的 地塞米松（大约13个细胞）进行上调之前的细胞；标有"加地塞米松"图像显示了加入24 纳米的地塞米松8小时（约14细胞）后的细胞。 图11显示了使用由SA0成像设备（20倍）组成的系统而获取的来自A549细胞的 FKBP5mRNA(亮/白点）两份有关图像（完整图像的1/10)。标有"减地塞米松"的图像显 示了加入24纳米的地塞米松（50个细胞以上）进行上调之前的细胞；标有"加地塞米松" 图像显示了加入24纳米的地塞米松8小时（50细胞以上）后的细胞。【具体实施方式】 本专利技术涉及单个分子成像，或单个分子的一个或多个集合，以及与成像相关的方 法。 单分子成像的方法通常包括以下步骤：1)将测试样品（即生物体、外来体、组织或 细胞）暴露给探针-其中探针包括一个特异结合至目标分子（即RNA、蛋白质、小分子）的 一个部分以及因与以一个或多个波长的光相互作用的一个或多个化学基团而可检测的一 个部分或改性后可包含与一个或多个波长的光相互作用的一个或多个化学基团的一个部 分-探针与目标分子结合，形成复合物；2)将复合物暴露给与所述一个或多个化学基团相 互作用的光的一个或多个波长；3)与所述一个或多个化学基团相互作用的光，检测与其一 个或多个波长相互作用而形成的结果，生成一个或多个单分子的影像，其中该成像系统只 需单个检测步骤便可在至少为1 X 105平方微米的成像区域上提供的检测分辨率高于450 纳米（即，采集的单组数据，而无需变更任何检测设置（即，光学器件和摄像机都不动）），从 而使单个分子或单个分子集合成像。所述成像系统通常为一个具有合成孔径光学作用（SAO 成像）或荧光偏振功能的装置而组成的系统。 "SA0成像"是指利用一组模式化或结构化的光照模式来照亮成像目标，以实现超 过成像装置（即镜头和相机）物理限制的分辨率的一种光学成像方法。在SA0成像方法中， 成像目标有选择性地激发，以检测目标的空间信息。由于在频率（或傅立叶）域和目标域 之间存在一对一的关系，SA0可以通过获取其空间频率信息而重构原始成像目标。 参见2010年3月19日提交的12/728110美国专利申请，其名称为"使用最低选择 性激发模式的合成孔径光学成像方法"，在此通过引用而并入本文。 "荧光偏振"指的是荧光团发射出的光具在不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单分子成像方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)将测试样品暴露给探针，其中所述探针包含特异结合至靶分子的第一部分，以及因与以一个或多个波长的光相互作用的一个或多个化学基团而可检测的第二部分，其中所述探针与靶分子结合，形成复合物；(b)将复合物暴露给与所述一个或多个化学基团相互作用的光的一个或多个波长；(c)与所述一个或多个化学基团相互作用的光，检测与其一个或多个波长相互作用而形成的结果，生成一个或多个单分子的图像，该图像在至少1×105平方微米的成像区域上具有高于450纳米的分辨率，且其中影像通过一个单一检测步骤便可得到，而无需改变任何检测设置。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克·比尔，罗纳德·库克，皮特·杰伊·科欣，阿图罗·奥贾卢，杰宽·瑞尤，
申请(专利权)人：生物研究技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US