本发明专利技术公开了甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA12及其应用。一种甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA12，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。其编码的蛋白质，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。所述的甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA12过表达植株对盐、干旱和ABA处理表现出敏感,说明BnNF-YA12参与植物的非生物胁迫调控过程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，设及甘藍型油菜核转录因子NF-YA基因化NF-YA12及 其应用。
技术介绍
NF-YA(CBF-B或HAP2)是转录调控因子NF-Y的一个亚基，它与另外两个亚基 NF-YB、NF-YC组成异源S聚体，共同结合于下游基因的CCAAT框上，从而激活或抑制基因的 表达（Romier等，2003)XCAAT-box-般位于启动子转录起始位点（TSS)上游-60~-lOObp 处，是启动子中的基本调控元件之一（Mantovani, 1999)。NF-Y是非常保守的一类转录调控 因子，每个亚基都有其特定的保守区域。NF-YA的保守区域位于C端，该区域负责与DNA序 列结合，引导NF-YB/NF-YC异源二聚体结合于CCAAT-box(Li等，1992)。关于NF-Y异源S 聚体的组装，一种可能的组装过程如图1-2所示；首先NF-?与NF-YC结合形成异源二聚 体，接着NF-YA再同异源二聚体结合形成完整的NF-Y，最后转录调控因子NF-Y与下游基因 的CCAAT框结合（Ronchi等，1995,Sinha等，1995)。研究发现在拟南芥中，NF-YA与C0的 蛋白结构相似。C0同样可W与NF-YB、NF-YC结合形成一个S聚体，该S聚体结合于FT基因 的启动子中的CCAAT框上，并激活FT基因的表达。当对NF-YA过表达时，植物会表现出FT 基因被抑制的现象。该说明在植物体内NF-YA与CO是相互竞争的关系，大量表达的NF-YA 会竞争性地与NF-YB/NF-YC异源二聚体结合，从而造成CO的脱祀，进而抑制了FT基因的表 达。miR169在植物中是一个很大的miRNA基因家族，目前已经在超过40个物种中 得到鉴定（Jones-化oades等，2006)，其在植物的生长和响应环境胁迫上起着重要的作 用（Lee等，2010)。在拟南芥中，miR169基因家族有14个成员，经加工最终形成的成熟 序列有4种。该四种成熟序列在环境胁迫下拥有独特的表达模式，预示着各自功能的已经 特殊化（Licausi等，2011，Sin曲等，2012,化3〇等，2011)。在植物中，miR169的祀基因 包括细胞色素C、蛋白磯酸酶7、CBF、NF-YA狂hou等，2012)。NF-Y转录调控因子可W结 合于下游基因启动子中的CCAAT框，从而激活或抑制下游基因的表达（Mantovani，1999)。 Li等研究发现，拟南芥miR69a/c在干旱处理下表达下调，其祀基因AtNF-YA5表达上调； AtNF-YA5的过表达拟南芥植株，在干旱处理下，叶片的失水减少，与WT植株相比抗旱性 更高；而ath-miR69a的过表达植株与敲除nf-ya5的突变体植株表型相同，都对干旱高 度敏感（Licausi等，2011)。Marco等对拟南芥大的NF-YA基因家族中受miR169调控的 AtNF-YA2/3/7/10进行过表达，实验结果显示，过表达AtNF-YA2/3/10会增强植株对多种非 生物胁迫的抗性狂hao等，2011)。在大豆中，通过分析GmNF-YA3在干旱胁迫下的表达模 式，发现其对干旱胁迫有反应。利用5'RACE和烟草瞬时表达证明GmNF-YA3是miR169的一 个祀基因。GmNF-YA3的过表达植株表现为叶片失水率低，在长期的干旱处理下也能存活，过 表达GmNF-YA3增强了植株的抗旱能力。同时，过表达GmNF-YA3的拟南芥对外源施加的ABA 很敏感，转基因植株体内与ABA生物合成、ABA信号传导W及胁迫响应相关的基因的转录水 平比野生型植株的要高。W上说明GmNF-YA3基因积极参与调节植物的抗旱功能。在杨树(Populustremuloides)中，ptr-miR169a和勒1 基因PtrHAP2-5(NF-YA2)参与调控杨树的休 眠（Potkar等，2013)。在番茄（Solanumlycopersi州m)中，sly-miR169 在干旱处理下表 达量增加，其祀基因SiNF-YAl/2/3的表达量降低狂hang等，2011)。综合上所述，miR169/ NF-YA调控模块在植物逆境胁迫中起着重要的作用，NF-YA主要是通过miR169调控途径来 参与逆境调控网络的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种甘藍型油菜小分子RNA基因bna-miR169o及其祀基因核 转录因子NF-YA基因化NF-YA12。 本专利技术的另一目的是提供基因化NF-YA12的应用。 本专利技术的目的可通过如下技术方案实现： -种甘藍型油菜核转录因子NF-YA基因化NF-YA12,其特征在于具有如SEQID NO. 1所示的核巧酸序列。[000引所述的甘藍型油菜核转录因子NF-YA基因化NF-YA12优选W甘藍型油菜"南盐油 1号"cDNA为模板，W化NF-YA12-F和化NF-YA12-R为引物，通过PCR扩增得到。 所述的甘藍型油菜核转录因子NF-YA基因化NF-YA12编码的蛋白质，具有如SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列。 一种甘藍型油菜小分子RNA基因bna-miR169o,其祀基因是权利要求1所述的甘藍 型油菜核转录因子NF-YA基因化NF-YA12,切割位点位于化NF-YA12的3 'UTR。 所述的甘藍型油菜小分子RNA基因bna-miR169o,优选W甘藍型油菜"南盐油1 号"cDNA为模板，Wbna-miR169〇-F和bna-miR169〇-R为引物，通过PCR扩增得到，具有如 SEQIDNO. 3所示的核巧酸序列。 一种含有本专利技术所述的甘藍型油菜核转录因子NF-YA基因化NF-YA12重组载体。 所述的重组载体，优选将甘藍型油菜核转录因子NF-YA基因化NF-YA12插入表达 载体PCAMBIA1302的化〇1和Spel酶切位点之间所得。 一种含有所述的甘藍型油菜核转录因子NF-YA基因化NF-YA12重组载体的根癌农 杆菌EHA105。 所述的根癌农杆菌，所述的重组载体经电转化转入根癌农杆菌EHA105中。 所述的甘藍型油菜核转录因子NF-YA基因化NF-YA12I在构建盐、干旱或外源ABA 敏感的转基因植物中的应用。 有益效果；[001引本专利技术提供了一株新的甘藍型油菜核转录因子NF-YA基因化NF-YA12,该基因与 已有的拟南芥、亚麻芥、白菜中的NF-YA9基因的蛋白序列同源度分别为73.8%、71.5%、 76. 4%。对bna-miR169o和化NF-YA12的转基因纯合体进行各项生理实验，结果显示 化NF-YA12的过表达植株对盐、干旱和ABA处理表现出敏感。说明化NF-YA12参与植物的非 生物胁迫调控过程。bna-miR169o的过表达植株与野生型的表型差不多，没有明显的差异。 可能的原因是拟南芥中不存在bna-miR169o的祀基因。【附图说明】 图1、甘藍型油菜小分子RNA基因bna-miR169o的前体扩增结果（A0UA08分别代 表A染色体组中的01和08染色体）； 图2、烟草瞬时表达验证结果 图3、PCR验证转基因植株在转录水平上的表达。A12代表化NF-YA12 图4、逆境处理下转基因拟南芥株系和野生型的萌发率。 图5、根的伸长率测定。图6、根系扫描本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甘蓝型油菜核转录因子NF‑YA基因BnNF‑YA12，其特征在于具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁明祥，陶庆，林钟员，殷祥贞，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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