一种铬-纤维蛋白原螯合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种铬-纤维蛋白原螯合物及其制备方法和应用，该铬-纤维蛋白原螯合物是铬离子与纤维蛋白原通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。本发明专利技术建立了铬-纤维蛋白原螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测铬-纤维蛋白原螯合物在评价一个地区铬污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铬-纤维蛋白原螯合物可以间接反映这个地区人群受铬污染的情况，从而间接反映这个地区铬污染程度。本发明专利技术建立的铬-纤维蛋白原螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及检测领域，更具体地说，设及一种铭-纤维蛋白原馨合物及其制备方 法和应用。
技术介绍
纤维蛋白原（fibrinogen,FG)其生理功能主要是作为凝血因子I而直接参与凝 血过程。在凝血共同途径中，凝血酶先裂解纤维蛋白原两条Aa链氨基端Argl6-Glyl7 释放出一对纤维蛋白肤A，形成纤维蛋白单体I;在裂解纤维蛋白原两条B0链氨基端 Argl4-Glyl5释放出一对纤维蛋白肤B，形成纤维蛋白单体II，暴露纤维蛋白单体的聚合部 位，通过非共价结合，形成了不稳定的可溶性纤维蛋白单体。在活化的凝血因子XIII及Ca" 的作用下，纤维蛋白单体互相交联，生成稳定的可溶性纤维蛋白，并将血液的有形成分包绕 其中，形成牢固的血栓。 除参与凝血外，纤维蛋白原还具有其他多种功能，如与血小板膜糖蛋白IIb/IIIa 结合而介导血小板聚集反应，参与动脉粥样硬化及肿瘤血行转移等；纤维蛋白原水平还影 响血液粘度，尤其近年来人们发现血浆纤维蛋白原水平升高是屯、脑血管、血栓性疾病的重 要危险因素。血浆纤维蛋白原也是急性时相蛋白，在很多应激状况下，如感染、严重外伤等 也可短时间内升高。 铭（chromium,Cr)是元素周期表VI族中的一种过渡金属，其质地坚硬，表面具有 光泽，有较高的烙点，在工业生产中具有重大的经济价值，一个世纪W来被广泛应用，每年 全球铭生产量高达107吨，因而铭是一种名副其实的重要金属污染物。目前，铭广泛应用于 电锻、踩革、颜料、油漆、合金、印染等各个方面，与人们的生活息息相关，但是同样也对人 类的身体健康产生巨大影响。在美国，化与化、(M、化被称为四大环境污染物。据统计，每 年有几十个亿的民众都在饮用铭污染的水源，而在加利福利亚有高达30%的水资源都已经 被铭污染，因而铭污染严重影响着人们的身体健康。 自然界中铭主要价和六价的形式存在，而一般认为，S价铭（化3+)是人类所 需的微量元素，而六价铭（化6+)才是明显的毒性物质。由于六价铭易通过细胞膜进入细胞， 而且可W通过一系列反应，产生强烈的细胞毒性及基因毒性，因而普遍认为六价铭的毒性 高于S价铭，达10-100倍。学者认为当水中的六价铭含量超过0.05mg/L即是有毒的。六 价铭可W通过皮肤接触、食物摄入、饮用水饮入、呼吸道吸入等途径进入人体，对于职业性 暴露人群主要是通过呼吸道吸入六价铭灰尘，而对于普通人群则是通过饮入污染水源、食 入被污染的食物、吸入等方式摄入六价铭。六价铭进入体内后，可W引发氧化应激、染色体 崎变、细胞调亡、多种DNA损伤（包括单链断裂、DNA-蛋白质交联、DNA-氨基酸交联、化-DNA 配合物形成等），从而造成机体多处组织、器官、系统损伤。不仅如此，六价铭还被认为是一 种强有力的致癌物，早在1990年国际癌症研究组织。 铭与多种蛋白质之间关系密化可W与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对铭毒性研究的深入，人们逐渐认识到铭与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解铭的毒性机理的关键所在，因此，对铭和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于铭与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与铭之 间的关系还不清楚，因而加强对于铭与蛋白质之间的关系至关重要。
技术实现思路
针对铭污染严重的问题，本专利技术的目的在于提供一种铭-纤维蛋白原馨合物及其 制备方法，并建立铭-纤维蛋白原馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测铭-纤维蛋 白原馨合物在评价一个地区铭污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铭-纤 维蛋白原馨合物可W间接反映该个地区人群受铭污染的情况，从而间接反映该个地区铭污 染程度。[000引本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是；提供一种铭-纤维蛋白原馨合物， 铭离子与纤维蛋白原通过琉基或/和半脱氨酸残基馨合而成。 本专利技术还提供一种上述的铭-纤维蛋白原馨合物的制备方法，包括W下步骤： A)铭与纤维蛋白原的馨合反应：在提纯源于人体的纤维蛋白原或按照生物学方 法重组的纤维蛋白原中加入铭离子进行馨合反应，得到反应溶液； B)纯化铭-纤维蛋白原馨合物的提取；采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未 反应的纤维蛋白原W及多余的铭离子，即得铭-纤维蛋白原馨合物。 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下；[001引 （1)溶解样品；向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使铭-纤维蛋白原 馨合物复溶； 似平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与纤维 蛋白原特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱； (3)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，纤维蛋 白原与填料特异性结合； (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I; (5)收集；收集洗脱液I;[001引 （6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地20透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本； (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铭特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱； (8)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤化）中样本，然后上柱； (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II; (10)收集；收集洗脱液II;[002引 （11)透析；将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得铭-纤维蛋白原馨合物。 其中，上述铭-纤维蛋白原馨合物的制备方法，还包括步骤C);对铭-纤维蛋白原 馨合物的鉴定； 其中，步骤C)中具体如下： (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床； (2)加样；取步骤B)中提取纯化得到的铭-纤维蛋白原馨合物，加入稀释缓冲液， 并混匀，然后加样于样品槽中；[00測 做电泳：连接电泳板，进行电泳； (4)检测；在胶床上找出含铭的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有铭W及检测铭的含量。 本专利技术还提供一种如上述的铭-纤维蛋白原馨合物在制备检测人体内铭-纤维蛋 白原馨合物的试剂或试剂盒中的应用。 本专利技术还提供一种至少包括如上述的铭-纤维蛋白原馨合物作为标准品的试剂 盒。 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获纤维蛋白原的物质或捕获 铭的物质。 本专利技术还提供一种定量检测铭-纤维蛋白原馨合物的方法，W已知含量的上述的 铭-纤维蛋白原馨合物作为标准品，采用W下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联 免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯铭-纤维蛋 白原馨合物与酶联免疫结合法、提纯铭-纤维蛋白原馨合物与原子吸收光谱结合法、提纯 铭-纤维蛋白原馨合物与电感禪合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱 或电感禪合等离子体质谱结合法。 实施本专利技术的铭-纤维蛋白原馨合物及其制备方法和应用，具有W下有益效果： 1.本专利技术首次体外合成铭-纤维蛋白原馨合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铬‑纤维蛋白原螯合物，其特征在于，铬离子与纤维蛋白原通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张积仁，阳帆，董欣敏，吴婧，蔡睿，孙遥，赵乙木，
申请(专利权)人：上海拜豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31