一种荧光定量RT-PCR实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)设计特异性引物3-UTR，其序列为：3-UTR For：5’-GTAGGACCCTATTGTAGATAA-3’；3-UTR Rev：5’-AGTTTATACCAGTTCTTACTCATTC-3’；2)对采集的血样进行编号，提取血样总RNA；3)以提取的总RNA为模板，用TARAKA试剂盒进行反转录得cDNA；4)以步骤3)反转录所得cDNA为模板，加入特异性引物，用TARAKA的SYBRgreen试剂盒进行荧光定量PCR扩增，记录实时荧光定量PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果，根据记录结果鉴别猪瘟病毒株；其中，特异性引物的终浓度为0.4μMol/L，PCR反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40循环。为猪瘟疫病控制及净化提供了可靠技术保障。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒或噬菌体的测定或检验方法
，尤其涉及一种精确、特异快速区分动物重大疫病的方法，具体说是一种荧光定量RT-PCR实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法。
技术介绍
猪瘟(Classicalswine fever，CSF)或(Hog cholera，HC)是一种严重危害猪的烈性病毒性传染病。由于CSF对养猪业危害巨大，且难以有效控制，世界动物卫生组织(OIE)曾经将其列为A类动物疫病，在2008版的《陆生动物法典》1.2.3.5中将其列为必须报告的7种猪的重要传染病之一。2008年我国农业部公告1125号《一、二、三类动物疫病病种名录》中也将其列为17种一类动物传染病之一。世界各国对CSF都采取严格的防控措施，将其控制或扑灭。OIE的最新资料显示，目前在中美洲、南美洲、欧洲、亚洲和非洲部分地区都有CSF的发生，北美、澳大利亚和新西兰已经消灭了 CSF。但从20世纪90年代开始，CSF又在部分国家和地区出现暴发和流行，如新西兰(1997)、德国(1993-2001)、比利时(1990，1993，1994)、意大利(1995，1996，1997)、英国(2000)、罗马尼亚(2000)、斯洛伐克(2000)、西班牙(2000)、新加坡(2007) ο保加利亚在2009年8月发生过CSF，2008-2010年I月俄罗斯、2009年墨西哥、2009年巴西、2010年瓜地马拉等国家和地区都有CSF发生病例的报告，可见CSF依然是目前猪群中重要的疫病。虽然各国都对其采取了严厉的措施，但不时仍有新病例的出现乃至疫病的暴发。对猪瘟的根除还需要下很大的气力，在本病的研宄上也还有许多未知的方面，需要进一步的深入研宄。对于猪瘟病毒野毒株和疫苗毒株的检测，通常可采用病毒分离鉴定技术，但该方法病毒分离鉴定耗时长，难以推广普及应用，难以应用于养殖场猪瘟病毒鉴定和疫病控制。为提高毒株检测的效率与准确度，曾设计出RT-PCR(Reverse Transcript1n-PCR)来检测组织样品中的病毒，该方法是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。虽然，RT-PCR具有很高的特异性和重复性，但无法实现定量检测。为解决定量检测的问题，曾采用荧光定量RT-PCR技术，以进一步提高检测的准确性。如申请公布号为CN102808040A的专利技术专利公开了 “一种实时荧光定量RT-PCR鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法”，该方法设计合成了 3条引物，Pl (5丨-TTGGCATCATTGCATAAGGG-3丨)为猪瘟强毒特异上游引物，P2(5r -GTGGTCTACACAGGGGGGGT-3r )为猪瘟兔化弱毒疫苗株特异上游引物，P3 C -GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3')为猪瘟病毒共用下游引物，P1/P3可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为549bp，Tm值为89.5±0.5°C；P2/P3可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为164bp，Tm值为84.5±0.5°C。在最优条件下进行荧光定量RT-PCR反应和复合荧光定量RT-PCR反应。为实现相近似的专利技术目的，本专利技术提供了另一种检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种荧光定量RT-PCR实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法，为猪瘟疫病控制及净化提供了可靠技术保障。本专利技术提供了如下技术方案:该荧光定量RT-PCR实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法，其技术要点是，包括以下步骤:I)设计特异性引物3-UTR，其序列为:3-UTR For:5，-GTAGGACCCTATTGTAGATAA-3，；3-UTR Rev:5’ -AGTTTATACCAGTTCTTACTCATTC-3’ ；2)对采集的血样进行编号，提取血样总RNA ; 3)以提取的总RNA为模板，用TARAKA试剂盒进行反转录得cDNA ；4)以步骤3)反转录所得cDNA为模板，加入特异性引物，用TARAKA的SYBRgreen试剂盒进行荧光定量PCR扩增，记录实时荧光定量PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果，根据记录结果鉴别猪瘟病毒株；其中，特异性引物的终浓度为0.4μΜο1/1，PCR反应条件为:950C预变性30s, 950C变性5s, 60°C退火30s, 72°C延伸30s，共40循环。本专利技术另提供了一种实时荧光定量RT-PCR鉴别检测猪瘟野毒强毒株的特异性引物，其技术要点是:所述特异性引物的序列为:3-UTR For:5，-GTAGGACCCTATTGTAGATAA-3，；3-UTR Rev:5’ -AGTTTATACCAGTTCTTACTCATTC-3’。在QuantStud1? 6Flex实时荧光定量PCR系统基础上建立了快速、灵敏、特异区分检测CSFV强毒株和疫苗毒株的SYBRgreen荧光定量PCR方法。经过对本专利技术所建立的方法进行特异性、灵敏度的验证，结果显示本方法可以区分检测猪瘟病毒(CSFV)强毒株和疫苗毒株，且与BVDV C24V株、PRRSV活疫苗TJ株、JEV活疫苗14-14-2株、PEDV/TGEV/PoRV三联活疫苗等病毒无交叉扩增反应。灵敏度检测可达10_5数量级，特异性强，对BVDV C24V株、PRRSV活疫苗TJ株、JEV活疫苗14-14-2株、PEDV/TGEV/PoRV三联活疫苗毒株等结果阴性。在QuantStud1? 6Flex实时荧光定量PCR系统上操作简单易行。【附图说明】图1为实时荧光定量RT-PCR技术检测猪瘟病毒特异性鉴定扩增曲线图；图1中，从左到右依次为:①CSFV石门株、②猪瘟活疫苗细胞源、③猪瘟活疫苗传代细胞源、④CSFV Thiverval株、⑤猪瘟活疫苗脾淋源，⑥BVDV C24V株、⑦PRRSV活疫苗TJ株、⑧JEV活疫苗14-14-2株、⑨PEDV/TGEV/PoRV三联活疫苗毒株没有出现扩增曲线；图2为特异性鉴定熔解曲线图(和图1相对应)；图3为特异性鉴定电泳结果(和图1相对应)； 图3中，M为DL500Marker，I为PBS阴性对照，2为DEPC水空白对照，3为猪瘟活疫苗细胞源，4为猪瘟活疫苗传代细胞源，5为猪瘟活疫苗脾淋源，6为CSFV Thiverval株，7为CSFV石门株，8为BVDV C24V株，9为PRRSV活疫苗TJ株，10为JEV活疫苗14-14-2株，11为PEDV/TGEV/PoRV三联活疫苗毒株；图4为实时荧光定量RT-PCR技术检测CSFV的灵敏度试验结果；图4中，从左到右的稀释倍数依次是依次为10°、10' 10' 10' 10' 10' 10'空白对照；图5为对12份送检血样荧光定量RT-PCR技术鉴别检测CSFV毒株的检测结果。【具体实施方式】以下结合图1?5，并通过具体实施例详细说明本专利技术的具体内容。以下依次通过特异性试验、灵敏度试验等阐述本实验方法的建立过程。特异性试验分别以①CSFV石门(Simen)株、②猪瘟活疫苗(细胞源)、③猪瘟活疫苗(传代细胞源)、④CSFV Thiverval株、⑤猪瘟活疫苗(脾淋源)，⑥BVDV C24V株、⑦PRR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光定量RT‑PCR实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)设计特异性引物3‑UTR，其序列为：3‑UTR For：5’‑GTAGGACCCTATTGTAGATAA‑3’；3‑UTR Rev：5’‑AGTTTATACCAGTTCTTACTCATTC‑3’；2)对采集的血样进行编号，提取血样总RNA；3)以提取的总RNA为模板，用TARAKA试剂盒进行反转录得cDNA；4)以步骤3)反转录所得cDNA为模板，加入特异性引物，用TARAKA的SYBRgreen试剂盒进行荧光定量PCR扩增，记录实时荧光定量PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果，根据记录结果鉴别猪瘟病毒株；其中，特异性引物的终浓度为0.4μMol/L，PCR反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40循环。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王钦富，高金源，胡亚萍，刘欢，王美辰，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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