一种结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法技术

本发明专利技术提供一种结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法，所述方法为将水牛体外受精胚胎培养至扩张囊胚，用激光破膜仪将囊胚腔打孔，排出囊胚液，然后用冷冻液进行玻璃化冷冻。在冷冻前将囊胚液排出，可使冷冻保护液更快速的进入胚胎，且减少了细胞内冰晶形成的可能性，从而很大程度上避免了胚胎损伤，可提高胚胎的冷冻存活率。另一方面，由于在冷冻前就将透明带进行了部分破除，因此在解冻培养后，可使复苏的囊胚腔更易孵出透明带，从而利于胚胎移植后在子宫内的着床，提高移植受胎率。

【技术实现步骤摘要】
一种结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法。
技术介绍
水牛体外生产胚胎对低温敏感且冷冻效率低，主要是由于体外培养条件不当造成胚胎质量不佳以及胚胎内脂滴多造成。对于水牛胚胎的超低温冷冻，如今主要采用玻璃化冷冻法，但是对于胚胎冷冻阶段、冷冻液和冷冻程序都没有统一的标准。而且水牛胚胎在冷冻前都未经任何处理，因此冷冻效率仍然较低，特别对于8-9d的囊胚而言，其冷冻效率仅为50-60％。此外，由于玻璃化冷冻-解冻后，胚胎的透明带厚度平均会增加2.8μm，冷冻后的胚胎孵化率也仅为50％左右，从而造成解冻胚胎移植后的受胎率仅为4-12％。因此需要发展一种冷冻手段保证水牛胚胎的冷冻效率，同时提高冷冻-解冻后胚胎的孵化率和移植受胎率。
技术实现思路
本专利技术提供一种结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法，可提高胚胎的冷冻存活率和移植受胎率。本专利技术所采取的技术方案是：一种结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法，所述方法为将水牛体外生产的胚胎培养至扩张囊胚，用激光破膜仪将囊胚腔打孔，排出囊胚液，然后用冷冻液进行玻璃化冷冻。进一步地，所述冷冻液由以下材料组成：浓度为20％的乙二醇(EG)溶液，浓度为20％的二甲基亚砜(DMSO)溶液，浓度为0.5M的蔗糖溶液。进一步地，所述方法包括以下步骤：(1)采用XYClone激光破膜系统，调整参数至90％脉冲强度，800μs的脉冲宽度，在囊胚内细胞团对面的透明带上作15-20μm的透明带切口，并击破囊胚腔使囊胚液流出；(2)取0.25mL塑料麦管在其一端用刀片作一30°的斜切面，用作水牛胚胎超低温冷冻载体；(3)将处理好的胚胎转入经室温平衡后的冷冻平衡液内保持5min，而后转入冷冻液内清洗2-3次，吸取囊胚混合少量冷冻液(小于1μL)放置于麦管斜切面的尖部，直接投入液氮保存；(4)从液氮罐内取出超低温冷冻保存的胚胎，直接浸入经室温平衡的解冻液内，晃动麦管，在显微镜下见囊胚脱出即可，囊胚在解冻液内停留5min，而后用CM液(胚胎培养液)清洗2-3次，转入覆盖石蜡油的40-50μLCM微液内，38.5℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养使其复苏。进一步地，所述冷冻液、冷冻平衡液、解冻液均采用TCM199和10％胎牛血清(FBS)混合溶液作为基础液。进一步地，所述冷冻平衡液由以下材料组成：浓度为20％的EG溶液，浓度为5％的DMSO溶液。进一步地，所述解冻液由以下材料组成：浓度为0.5M的蔗糖溶液。本专利技术的有益效果是：本专利技术在冷冻前将囊胚液排出，可使冷冻保护液更快速的进入胚胎，且减少了细胞内冰晶形成的可能性，从而很大程度上避免了胚胎损伤，可提高胚胎的冷冻存活率。另一方面，由于在冷冻前就将透明带进行了部分破除，因此在解冻培养后，可使复苏的囊胚腔更易孵出透明带，从而利于胚胎移植后在子宫内的着床，提高移植受胎率。【具体实施方式】下面结合具体的实施例来进一步说明本专利技术，但并不以此来限制本专利技术的范围。实施例1一种结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法，所述方法为将水牛体外生产的胚胎培养至扩张囊胚，用激光破膜仪将囊胚腔打孔，排出囊胚液，然后用冷冻液进行玻璃化冷冻。在本实施方式中，所述冷冻液由以下材料组成：浓度为20％的乙二醇(EG)溶液，浓度为20％的二甲基亚砜(DMSO)溶液，浓度为0.5M的蔗糖溶液。进一步地，所述结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法还包括以下步骤：(1)采用XYClone激光破膜系统，调整参数至90％脉冲强度，800μs的脉冲宽度，在囊胚的内细胞团对面的透明带上作15-20μm的透明带切口，并击破囊胚腔使囊胚液流出。(2)取0.25mL塑料麦管在其一端用刀片作一30°的斜切面，用作水牛胚胎超低温冷冻载体。(3)将处理好的胚胎转入经室温平衡后的冷冻平衡液内保持5min，而后转入冷冻液内清洗后，吸取囊胚混合少量冷冻液(小于1μL)放置于麦管斜切面的尖部，直接投入液氮保存。在本实施方式中，所述冷冻平衡液、冷冻液与解冻液均采用TCM199+10％胎牛血清(FBS)混合液作为基础液；所述冷冻平衡液由以下材料组成：浓度为20％的EG溶液，浓度为5％的DMSO溶液。(4)从液氮罐内取出超低温冷冻保存的胚胎，直接浸入室温平衡的解冻液内，晃动麦管，在显微镜下见囊胚脱出即可。囊胚在解冻液内停留5min，而后用CM液(胚胎培养液)清洗2-3次，转入覆盖石蜡油的40-50μLCM微滴内，38.5℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养使其复苏。在本实施方式中，所述解冻液由以下材料组成：浓度为0.5M的蔗糖溶液。对照组的囊胚未经破膜处理，直接按照上述的方法进行冷冻，而破膜组即是将囊胚进行破膜后再进行冷冻。实验结果如下：表1.破膜对不同胚龄囊胚冷冻存活率的影响注：表中同行数据比较上表不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。表2.破膜对不同胚龄囊胚冷冻后孵化率的影响注：表中同行数据比较上表不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。从表中可见激光破膜后冷冻对胚龄为6-7d的囊胚的冷冻存活率及解冻后的孵化率没有显著影响，但提高了8d囊胚的冷冻存活率和解冻后孵化率，尤其显著提高了9d囊胚的冷冻存活率和孵化率。将解冻后存活的两组囊胚分别移植入经同期发情处理的受体母水牛子宫内，结果表明对照组和破膜组的6d囊胚移植受胎率分别为31.7％(13/41)和32.9％(24/73)，7d囊胚移植受胎率分别为35.7％(5/14)和22.9％(8/35)，两组均没有显著差异。而移植8-9d囊胚后的受胎率分别为4.2％(1/24)和18.2％(4/22)。由此可见，本专利技术可以显著提高8-9d冷冻囊胚的移植受胎率。从以上可见，本专利技术对于冷冻6-7d囊胚具有很好的冷冻效率、孵化率和移植受胎率，特别可提高8-9d囊胚的冷冻存活率、孵化率和移植受胎率，从而大大的提高水牛胚胎的利用效率，对于水牛的遗传改良具有重要的意义。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法，其特征在于：所述方法为将水牛体外生产的胚胎培养至扩张囊胚，用激光破膜仪将囊胚腔打孔，排出囊胚液，然后用冷冻液进行玻璃化冷冻。

【技术特征摘要】
1.一种结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法，其特征在于：所述方法为将水牛体外生产的胚胎培养至扩张囊胚，用激光破膜仪将囊胚腔打孔，排出囊胚液，然后用冷冻液进行玻璃化冷冻，包括以下步骤：(1)采用XYClone激光破膜系统，调整参数至90％脉冲强度，800μs的脉冲宽度，在囊胚内细胞团对面的透明带上作15-20μm的透明带切口，并击破囊胚腔使囊胚液流出；(2)取0.25mL塑料麦管在其一端用刀片作一30°的斜切面，用作水牛胚胎超低温冷冻载体；(3)将处理好的胚胎转入经室温平衡后的冷冻平衡液内保持5min，而后转入冷冻液内清洗2-3次，吸取囊胚与小于1μL的冷冻液混合，放置于麦管斜切面的尖部，直接投入液氮保存；(4)从液氮罐内取出超低温冷冻保存的胚胎，直接浸入经室温平衡的解冻液内，晃动麦管，在显微镜下见囊胚脱出即可，囊胚在解冻液内停留5min，而后...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春艳，尚江华，郑海英，谷毅鹏，黄芬香，梁贤威，黄锋，陈明棠，覃广胜，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水牛研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45