本发明专利技术属于多肽合成领域，涉及一种液固结合制备胸腺法新的方法，本发明专利技术采用液相方式合成连续氨基酸的二肽片段，以二肽片段投料固相合成，解决了这些位点难以偶联，容易生成缺失肽的问题，同时提高的粗肽的纯度与收率，利用此工艺制备胸腺法新，可使粗肽纯度达到75%以上。与现有技术相比，本发明专利技术合成路线简单，着重解决了困难位点不易偶联及易生成缺失肽的问题，降低了合成成本及纯化成本，利于工业大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽合成领域，特别涉及一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方 法。
技术介绍
胸腺法新（Thymosin)，商品名日达仙，由美国SciClone公司申请，意大利Patheon 公司生产。目前已在全球五十多个国家上市，适应症有慢性乙肝，慢性丙肝，癌症辅助药物， 疫苗增强剂，免疫刺激剂。此外，治疗肝癌及恶性黑色素瘤已完成二期临床。胸腺法新有着 良好的安全记录，根据治疗超过30万例患者的经验看来，被证明无明显的副作用以及有很 好的耐受性。胸腺法新被用于治疗老年患者（高达101岁），儿童患者（仅13个月大）以 及免疫功能低下患者，并未引专利技术显副作用以及毒性反应。此外，胸腺法新与其他药物，例 如干扰素结合治疗时并无明显的恶化副作用的现象出现。在动物实验中，胸腺法新以高于 推荐使用量800倍的剂量测试时并无证据显示不良的临床症状发生。 胸腺法新是由28个氨基酸组成的多肽，氨基酸序列如下所示：Ac-Ser-Asp-Ala-A Ia-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Va I-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH 目前，胸腺法新的合成主要有化学合成法（如CN 10409688 A，CN 102199205)及基 因工程法（如CN1431311)，其中基因工程法工艺繁琐，纯化复杂，应用不如固相合成法普 遍。专利CN 102199205公开了一种逐个氨基酸偶联的固相合成方法，但该方法合成周期 长，困难位点连接效率低，缺失肽严重；专利CN 10409688 A公开了一种以片段方式偶联 合成胸腺法新的方法，将胸腺法新肽链分成三段，之后片段连接完成胸腺法新合成；专利 201310202015. 1 在合成 26 位 Ala 和 27 位 Glu 时引入片段二肽 Fmoc-Ala-Glu (OtBu)-OH, 解决了采用CTC树脂合成胸腺法新中二肽Glu-Asn容易从树脂上断裂下来的难题；总之，这 类使用肽片段的合成方法虽然解决了部分困难位点难于偶联、部分肽片段容易从树脂上断 裂下来的难题，但是仍不能解决胸腺法新中多个连续氨基酸片段的合成、纯化以及偶联过 程中的反应效率低、损失严重等问题。 众所周知，胸腺法新含有多个连续氨基酸片段，例如23~22位的Val~Val，20 位~19位的Lys~Lys，13位~12位的Thr~Thr，9位~8位的Ser~Ser，4位~3位 的Ala~Ala ;在胸腺法新合成过程中经检测发现，除23位~22位的连续Val相对容易连 接之外，剩余四个连续氨基酸偶联均较为困难、连接效率不高；并且在固相合成过程中，连 续氨基酸往往容易产生缺失肽，且部分缺失肽在后续纯化过程中难以分离。
技术实现思路
为解决胸腺法新合成中所遇到的以上难点，本专利技术提供一种以二肽片段液固结合 制备胸腺法新的方法，既能避免缺失肽的生成，又能提高总体合成效率，解决19位，12位，8 位，3位偶联困难需要连续复投的问题；同时与逐个位点偶联相比，因解决了四个位点的偶 联困难问题，可较大幅度的提高最终粗肽的纯度和收率。与片段偶联相比，合成过程简便， 物料成本降低，有利于胸腺法新的工业化大规模生产。 为实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案： 一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，包括如下步骤： (a) Fmoc-Lys (Boc) -OSu 与 H-Lys (Boc) -OH 在碱 A 溶液中偶联生成二肽 Fmoc-Lys (Boc) -Lys (Boc) -OH ;Fmoc-Thr (tBu) -OSu 与 H-Thr (tBu) -OH 在喊 A 溶液中偶联生 成二肽 Fmoc-Thr (tBu) -Thr (tBu) -OH ;Fmoc-Ser (tBu) -OSu 与 H-Ser (tBu) -OH 在喊 A 溶液中 偶联生成二肽 Fmoc-Ser (tBu) -Ser (tBu) -OH ;Fmoc-Ala_OSu 与 H-Ala-OH 在喊 A 溶液中偶联 生成一狀 Fmoc_Ala_Ala_OH。 (b)以WangResin或CTC树脂为固相载体，在偶联剂存在下，依次 与 Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-〇H，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-0H， Fmoc-Glu(OtBu) -OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-〇H， Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-〇H，Fmoc-Glu(OtBu)-〇H，Fmoc-Lys(Boc)-〇H，Fmoc-Leu-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-〇H，Fmoc-Lys(Boc)-〇H，Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-〇H，Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH发生偶联接肽反应；经N端乙酰化后，得侧链保护的胸腺法新肽树脂，其 结构如下； AC-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-G Iu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(-Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-WangResin; (c)胸腺法新肽树脂经过裂解，纯化，冻干得到胸腺法新精肽。 其中步骤（a)中所述的二肽片段Fmoc-Lys 〇oc) -Lys (Boc)制备方法为：将 H-Lys(Boc)-OH和碱A按照摩尔比1:1~2的比例溶解在水中，加入5~20%体积的有 机溶剂B助溶，待完全溶解后，搅拌下滴加入0. 8~I. 0倍摩尔量（以H-Lys(Boc)-OH的 量计）Fmoc-Lys (Boc)-OSu有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去 掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,乙酸乙酯萃取，析晶得 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH。 步骤（a)中所述的二肽片段Fmoc-Thr (tBu) -Thr (tBu) -OH的制备方法为：将 H-Thr (tBu)-OH和碱A按照摩尔比1:1~2的比例溶解在水中，加入5~20%体积的有 机溶剂B助溶，待完全溶解后，搅拌下滴加入0. 8~I. 0倍摩尔量（以H-Thr (tBu)-OH的 量计）Fmoc-Thr (tBu)-OSu有机溶剂B溶液；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去 掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以二肽片段液固结合制备胸腺法新的方法，其特征在于，包括如下步骤：（a）Fmoc‑Lys(Boc)‑OSu与H‑Lys(Boc)‑OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc‑Lys(Boc)‑Lys(Boc)‑OH；Fmoc‑Thr(tBu)‑OSu与H‑Thr(tBu)‑OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc‑Thr(tBu)‑Thr(tBu)‑OH；Fmoc‑Ser(tBu)‑OSu与H‑Ser(tBu)‑OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑OH；Fmoc‑SAla‑OSu与H‑Ala‑OH在碱A溶液中偶联生成二肽Fmoc‑Ala‑Ala‑OH ;(b)以Wang Resin或CTC树脂为固相载体，在偶联剂存在下，依次与Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Ala‑OH，Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Glu(OtBu)‑ OH，Fmoc‑Val‑OH，Fmoc‑Val‑OH，Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Lys(Boc)‑Lys (Boc)‑OH，Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Lys(Boc)‑OH，Fmoc‑Leu‑OH，Fmoc‑ Asp(OtBu)‑OH，Fmoc‑Lys(Boc)‑OH，Fmoc‑Thr(tBu)‑Thr(tBu)‑OH，Fmoc‑Ile‑ OH，Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑OH，Fmoc‑Thr(tBu)‑OH， Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH，Fmoc‑Val‑OH，Fmoc‑Ala‑Ala‑OH，Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH，Fmoc‑Ser(tBu)‑OH发生偶联接肽反应；经N端乙酰化后，得侧链保护的胸腺法新肽树脂，其结构如下： (c)胸腺法新肽树脂经过裂解，纯化，冻干得到胸腺法新精肽。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，陈雷，王仁友，李同金，石鑫磊，
申请(专利权)人：济南康和医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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