雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法技术

本发明专利技术涉及雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法，包括如下步骤：取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min；分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干；残渣用初始流动相定容，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。本发明专利技术的检测方法简单高效、快速灵敏、准确度高，具有广泛的实用性，能够应用于生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。

【技术实现步骤摘要】
雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法
本专利技术属于生物样品检验领域，具体涉及雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法。
技术介绍
雷公藤(TriptergiumwilfordiiHook.f)是卫矛科一年生藤本植物，是我国传统医学中的一种常用中草药。雷公藤为卫矛科植物雷公藤的根。分布于长江流域以南及西南，主产于长江中、下游地区。有报道称，目前从雷公藤属植物中分离得100余种成分，主要是二萜类、三萜类、倍半萜类及生物碱类等，研究表明，生物碱、二萜类等许多成分既是有效成分又是有毒成分，以二萜类化合物毒性最强，主要对心、肝、胃肠道及骨髓等器官损伤严重。雷公藤甲素和雷公藤氯内酯醇(tripchlorolide)是雷公藤中活性最高的环氧二萜内酯化合物，同时也是雷公藤引起毒副作用的主要成分，对心、肝、骨髓、胸、脾、肾及生殖系统等都有一定的毒性。雷公藤红素是雷公藤三萜类成分，是雷公藤中分离到的第1个单体，虽具有多种药理活性，但却是主要的毒性成分，且在雷公藤药物尤其是根皮、茎皮重含量很高。
技术实现思路
本专利技术提供雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法，适用于生物样品(血、尿、肝、肾等)中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的定性定量检验，也适用于体外样品和可疑物证的检验。本专利技术的原理是以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物样品进行提取、净化及浓缩后，用液相色谱-串联质谱仪进行检测，以保留时间(Rt)、质谱特征离子碎片峰和相对丰度作为定性判断依据；与平行操作的添加标准品响应值比较，根据峰面积之比，用外标法进行定量分析。具体的，本专利技术一方面的目的在于提供雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法，其特征在于，包括如下步骤：a)取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min；分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干；残渣用初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析；b)样品分析：色谱柱：kinetexC18；进样量：1μL～10μL；流动相：A为含0.1％甲酸的10mM甲酸铵【本专利技术0.1％甲酸的10mM甲酸铵是指：浓度为10mmol/L的甲酸铵水溶液中甲酸的体积分数为0.1％，以下不再赘述】，B为甲醇；梯度洗脱【本专利技术中的A、B均为体积分数，以下不再赘述】：0.2min，A为95％，B为5％；3.0min，A为5％，B为95％；5.0min，A为5％，B为95％；5.1min，A为95％，B为5％；7.0min，A为95％，B为5％；流速为0.5mL/min；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：5500V；离子源温度：650℃；雾化气压力：55psi；气帘气压力：50psi；辅助气压力：50psi。在本专利技术的另一个实施方案中，尤其是对于新鲜血液样品，其中a)样品前处理还能够替换为：取生物液体样品或生物组织样品剪碎于具塞试管中；加入pH5.8磷酸盐缓冲液，充分混旋，超声15min，8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱；取3CCHLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0.5mL/min～1.0mL/min；再以3mL去离子水和0.5％甲醇水溶液【本专利技术中0.5％甲醇水溶液是指：甲醇水溶液中甲醇的体积分数为0.5％，以下不再赘述】先后淋洗小柱；用4mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50℃快速浓缩仪上吹干，残渣用初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。在本专利技术的一个具体的实施方式中，其中a)样品前处理步骤中，还包括另取3份相同基质的空白样品，1份作为空白样品，另2份添加雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准100ng制备成添加样品，混匀；或者还包括另取相同基质的空白样品两份，分别添加相应目标物标准品(添加量应与案件样品粗测量相近)制备成添加样品，混匀。在本专利技术的一个具体的实施方式中，液体样品为血液、尿液、唾液；所述组织样品为肝脏、肾脏。在本专利技术的一个具体的实施方式中，C18柱为3.0mm×50mm，2.6μm柱或等效色谱柱。在本专利技术的一个优选的实施方式中，取液体样品1.0mL-2.0mL；或者组织样品1.0g-2.0g。在本专利技术的一个优选的实施方式中，乙酸乙酯的加入量为5.0mL-10.0mL。在本专利技术的一个优选的实施方式中，残渣用500μL-1000μL初始流动相定容。在本专利技术的一个优选的实施方式中，磷酸盐缓冲液的加入量为3mL-5mL。本专利技术另一方面的目的在于提供生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检验方法的应用，应用于法庭科学领域，尤其是应用于生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。优选地，所述生物样品为血、尿、肝、肾。本专利技术的有益效果在于：本专利技术样品处理采用液液萃取或者固相萃取，操作简单，样品用量少；采用LC-MS/MS灵敏度高，能有效的排除假阳性，定性、定量准确度高。附图说明图1表示雷公藤甲素的液相色谱-质谱提取离子流图；图2表示雷公藤内酯酮的液相色谱-质谱提取离子流图；图3表示雷公藤内酯甲的液相色谱-质谱提取离子流图；图4表示雷公藤红素的液相色谱-质谱提取离子流图。具体实施方式实施例1定性分析1、试剂本专利技术试验用水为一级水(见GB/T6682-2008规定)：a)磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠为分析纯；b)甲醇、乙腈、二乙胺、异丙醇、醋酸铵、甲酸、乙酸乙酯、环已烷均为色谱纯；c)磷酸盐缓冲液(pH5.8)：取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,，分别置于1000mL容量瓶中，加一级水溶解、稀释至刻度；d)含0.1％甲酸的10mM醋酸铵：称取0.384g的醋酸铵,加入一定量的一级水溶解，并加入0.5mL甲酸混匀，将混合液用一级水稀释至500mL；e)标准溶液：1)雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准储备液：精确称取雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准品各10mg，分别于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，配制成1.0mg/mL雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准储备液，冷藏保存6个月；2)雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准工作液：精确量取1.0mg/mL雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准储备液各10mL，分别于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0.10mg/mL的雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准工作液，冷藏保存1个月。试验中所用其它浓度的标准溶液均从上述储备溶液用甲醇稀释而得，冷藏保存为1个月。2、仪器和材料a)液相色谱-串联质谱仪本文档来自技高网...

【技术保护点】
雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱‑串联质谱检验方法，其特征在于，包括如下步骤：a)取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min；分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干；残渣用初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱‑串联质谱仪分析；b)样品分析：色谱柱：kinetex C18；进样量：1μL～10μL；流动相：A为含0.1％甲酸的10mM甲酸铵，B为甲醇；梯度洗脱：0.2min，A为95％，B为5％；3.0min，A为5％，B为95％；5.0min，A为5％，B为95％；5.1min，A为95％，B为5％；7.0min，A为95％，B为5％；流速为0.5mL/min；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：5500V；离子源温度：650℃；雾化气压力：55psi；气帘气压力：50psi；辅助气压力：50psi。

【技术特征摘要】
1.雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法，其特征在于，包括如下步骤：a)取生物液体样品1.0mL-2.0mL或生物组织样品1.0g-2.0g剪碎于具塞试管中；加入pH5.8磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的加入量为3mL-5mL，充分混旋，超声15min，8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱；取3CCHLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0.5mL/min～1.0mL/min；再以3mL去离子水和0.5％甲醇水溶液先后淋洗小柱；用4mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50℃快速浓缩仪上吹干，残渣用500μL-1000μL初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析；b)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳琳，栾玉静，应剑波，姚伊人，刘耀，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，
类型：发明
国别省市：北京;11