本发明专利技术公开了一种S100A9重组腺病毒、其构建及应用。具体地，本发明专利技术公开了一种S100A9重组腺病毒载体质粒：将S100A9蛋白编码基因重组至pHBAd-MCMV-RFP载体得到所述S100A9重组腺病毒载体质粒，所述S100A9蛋白编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。S100A9重组腺病毒载体质粒和骨架质粒转染HEK293细胞得到S100A9重组腺病毒Ad-S100A9。重组腺病毒Ad-S100A9转入宫颈鳞癌C33A细胞，并研究S100A9对宫颈鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，设及一种重组腺病毒，具体设及一种S100A9重组腺病 毒、其构建及应用。
技术介绍
在严重危害女性健康的恶性肿瘤中，宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，位于第二。据 全球范围统计，宫颈癌每年的新发病例大约有50万，其中发展中国家占80%W上。且近年 宫颈癌的发病有年轻化趋势。大量的研究表明，高危型人乳头瘤病毒（HPV)持续感染是宫 颈癌发病的首要因素，但大多数HPV感染的女性并未发展为宫颈癌。说明宫颈癌的发生发 展是一个多因素、多步骤、多基因参与的过程，但具体的发生发展机制还尚未明确。故深入 探讨宫颈癌发生发展的机制，将为宫颈癌的治疗提供新的思路和实验依据。C33A细胞是人 宫颈鱗癌细胞系，是宫颈癌研究常用的细胞系。S100属于巧结合蛋白家族，是一类只在脊柱动物中发现的小分子酸性蛋白。 S100A9为其中一个成员，常与S100A8结合形成异二聚体。通过与第二信使之一Ca2+结合， W及与祀蛋白的相互作用，参与多种生物学功能，如细胞的分化、增殖、黏附、迁移和信号转 导等。S100A9位于1号染色体长臂2区1带（lq21)，该区段稳定性差，容易发生染色体缺 失、重排、易位或重叠等，故推测其可能参与肿瘤的发生发展。近年来研究表明，S100A9在 多种恶性肿瘤中表达上调，如口腔舌癌、未分化的甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、膀脱癌和卵巢癌 等。 在前期研究中，采用免疫组织化学的方法，发现S100A9在正常宫颈组织、宫颈上 皮内瘤变、宫颈鱗癌中的表达逐渐增高，但S100A9在宫颈癌发生发展中的具体机制尚缺乏 客观的依据。[000引前期的研究中，比较分析C33A，MS751，Si化，CaSki等宫颈鱗癌细胞系中S100A9mRNA和S100A9蛋白的表达，发现S100A9mRNA和S100A9蛋白均在C33A宫颈鱗癌细 胞系中的表达最低，所W本专利技术选择宫颈鱗癌C33A细胞作为进一步研究S100A9重组腺病 毒转染细胞使S100A9高表达对细胞生物学行为影响的细胞。
技术实现思路
本专利技术通过重组腺病毒技术，构建宫颈鱗癌C33A细胞的S100A9重组腺病毒，探讨 S100A9对宫颈鱗癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 本专利技术提供了一种S100A9重组腺病毒载体质粒，将S100A9蛋白编码基因重组至 pHBAd-MCMV-RFP载体得到所述S100A9重组腺病毒载体质粒，所述S100A9蛋白编码基因的 序列如SEQIDN0:1所示。 优选地，上述的S100A9重组腺病毒载体质粒由经I和化iI双酶切的 pHBAd-MCMV-RFP载体与S100A9蛋白编码基因连接、转化后构建而成。 本专利技术提供上述的S100A9重组腺病毒载体质粒的构建方法，包括如下步骤； (1) 设计引物 S100A9蛋白编码基因的引物如下； S100A9-Afo幻-F:ACACGCGGCCGCATGACTTGCAAAATGT; S100A9-化il-R:ACACGATGCATTTAGGGGGTGCCCT; (2) W含有S100A9蛋白编码基因的RNA逆转录后为模板，用所述引物和DNA聚合酶进 行聚合酶链式反应扩增，纯化，得到扩增产物； (3) pHBAd-MCMV-RFP载体扩增和双酶切 将pHBAd-MCMV-RFP载体用I和化il双酶切，酶切完成后，胶回收纯化； (4) 将步骤2)得到的扩增产物和步骤3)经过双酶切的载体进行连接、转化、提取，即可 得到重组腺病毒载体质粒pHBAd-MCMV-RFP-S100A9。 优选地，步骤4)中的转化包括如下步骤；步骤2)得到的扩增产物和步骤3)经过 双酶切的载体进行连接后得到的连接产物中加入感受态细胞，冰上解育20-30min，40~45°C 下水浴60~120sec，于冰上速冷2-3min，加入LB培养基，35~40°C振荡温育，离心取重悬沉 淀，混匀后取适量均匀涂于平板，置于37°C培养箱中倒置培养；在LB培养基中加入氨节青 霉素构成培养基，取平板上培养得到的单克隆接种到所述培养基中，37 °C培养箱中，振荡。 进一步优选地，所述感受态细胞为D册a感受态细胞。 本专利技术还提供一种S100A9重组腺病毒，其上述的S100A9重组腺病毒载体质粒和 骨架质粒转染肥K293细胞得到重组腺病毒Ad-S100A9。[001引优选地，所述骨架质粒为pHBAd-BHG。 更优选地，转染肥K293细胞所用的转染试剂为LipofiterTM。本专利技术还提供上述的S100A9重组腺病毒的应用；将所述重组腺病毒Ad-S100A9转 入宫颈鱗癌C33A细胞，研究S100A9对宫颈鱗癌生物学行为包括细胞增殖、侵袭和迁移的影 响。 本专利技术构建人宫颈鱗癌C33A细胞的S100A9重组腺病毒，介导S100A9的高表达， 为研究S100A9对宫颈鱗癌生物学行为包括细胞增殖、侵袭和迁移提供良好的实验基础及 依据，及其在细胞内的功能提供了更直接便捷的工具。且pHBAd-MCMV-RFP载体及限制性内 切酶和连接酶等试剂购买方便，操作简单，重组腺病毒稳定。【附图说明】 图1为pHBAd-MCMV-RFP过表达载体图谱。[001引图2为pHBAd-MCMV-RFP载体胶回收，琼脂糖凝胶电泳结果示意图。 图3为S100A9PCR产物，琼脂糖凝胶电泳结果示意图。 图4为S100A9单克隆鉴定PCR产物，琼脂糖凝胶电泳结果示意图。 图5为Westernblot检测S100A9蛋白表达的示意图。 图6为S100A9重组腺病毒转染C33A细胞后对细胞侵袭能力的影响示意图。 图7为S100A9重组腺病毒转染C33A细胞后对细胞迁移能力的影响示意图。【具体实施方式】 下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，W使本领域的技术人员可W 更好的理解本专利技术并能予w实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。一、重组腺病毒载体质粒pHBAd-MCMV-RFP-S100A9的构建及鉴定 1. 酶切 附图1是pHBAd-MCMV-RFP过表达载体的示意图和其中的关键点。I和化iI为插入位点，pHBAd-MCMV-RFP载体用I和化iI双酶切，酶切 体系如下： 20uL酶切体系 37°C化2. 胶回收及纯化 (l)DNA电泳结束后，用洁净刀片在紫外线灯下切出相应片段。仔细将胶块中无DNA部 分去除掉。 (2)含DNA的琼脂糖胶块装入1. 5血离屯、管，估算其体积。加入500yL(< 150yL 凝胶）或3-4倍（> 150yL凝胶）凝胶体积的BufferPS(溶胶结合液)。 (3)离屯、管置于50-60°C水浴5-lOmin，每隔2-3min取出混悬振荡lOsec，至琼脂 糖凝胶完全溶解，室温放置5min冷却。 (4)将少于700UL融化胶液转移至插入套管的离屯、柱内，于台式离屯、机上高速离 屯、Imin，弃去套管内废液，再将离屯、柱插入套管。 (5)多于700化的剩余融化胶液，加入同一离屯、柱内，重复步骤（4)。 (6)向离屯、柱内加入BufferPW(洗漆液）700uL，高速离屯、Imin，弃去套管内废 液，将离屯、柱插入套管。 (7)高速离屯、l-2min后，小屯、取出离屯、柱，不要沾上套管内的废液。弃去套管。 [003引 （8本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种S100A9重组腺病毒载体质粒，其特征在于，将S100A9蛋白编码基因重组至pHBAd‑MCMV‑RFP载体得到所述S100A9重组腺病毒载体质粒，所述S100A9蛋白编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱雪琼，陈苗苗，王颖，沈奇，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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