本发明专利技术涉及包围纳米化或微米化粒子的模型脂质双层，所述粒子包含固定到粒子表面上的膜蛋白和一层在膜蛋白之间占据并包封所述粒子的脂质双层，其中所述膜蛋白通过长度最多5.5nm的接头分子固定到粒子表面上，以及在膜蛋白配体结合或活性测定中使用所述粒子的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】脂质膜包封的具有膜蛋白的粒子 本专利技术设及模型脂质双层和在其中支撑的膜蛋白。 膜蛋白在每个活细胞中发挥关键作用，该由生物的编码膜蛋白的大量基因体现。 20-30%的生物基因编码膜蛋白。该些蛋白质是细胞代谢例如细胞-细胞相互作用、信号转 导和离子及养分运输中的关键因素。因此，膜蛋白是约60%的全部药物的祀。然而，膜蛋白 的机理性细节有时难W获得，尤其是当不可忽略膜/水界面的作用时。已经开发了生物模 拟膜系统，从已经重构有膜蛋白的脂质体至平面状脂质双层或束缚的双层脂质膜。 与生物学中的该种基本职能相反，实验性技术仍难W接近膜蛋白。难W进行膜蛋 白的结构及功能表征，原因在于它们的两性特性。实验挑战在于，一旦它们从天然脂质双层 取出并在去垢剂的辅助下溶解，膜蛋白对变性敏感。为了模拟天然脂质环境，将溶解的膜蛋 白再整合（重构）在人工脂质双层或脂质类似物中。 生物膜的各种模型系统解决了该个问题。将溶解的膜蛋白纯化并重构；即，再整合 在模拟质膜中其天然环境的（人工）脂质双层中。在经典脂质体系统中，脂质双层包围一 个内腔。因此当需要控制内区室的内容物或溶质浓度时，实验难题出现。对于施加限于通 过使用离子特异性离子载体生成扩散电势的跨膜电位而言，同样如此。 已经应用几种在固相支持物上的重构策略，如向杂合脂质双层膜插入链烧 硫醇和磯脂的自装配单层、束缚的脂质双层膜（Knoll等人，ReviewsinMolecular Biotechnology74(2000) 137)、聚合物膜和Langmuir-Blodgett薄膜。 为了控制固定化膜蛋白的取向，Giess炬iophys.J. 87,（2004)，3213-3220)和 Ataka等人（J.Am.Chem.Soc. 2004, 126, 16199-16206)公开了借助His标签和Ni-次氮基S 己酸（NTA)部分在表面上固定膜蛋白并在脂质环境中通过原位透析进一步重构溶解的蛋 白质。 公开W0 2008/118688A2披露了一种稳定的、支撑的脂质双层膜，其中膜通过固定 至表面上的固醇分子稳定化。在制造该种膜期间，第一固醇分子固定在表面上并且随后用 膜溶液重构膜。膜溶液可W含有膜蛋白。该些膜模型存在W下问题；分子在膜中的活动性 低和膜下缺少任何含水层，而该通常是天然膜蛋白活性和行为所必需的。 JP2011/027632A描述了具有脂质双分子膜的生物巧片，所述脂质双分子膜W基 底上亲水性部分和疏水性部分的一种样式固定到基底上。 US2008/0304068A1设及具有层状设置的蛋白质生物巧片，所述层状设置包含金 属层和任选地在有源层上的脂质双层膜。如W0 2008/118688A2所提到，该种设置不合适 研究膜蛋白并且在W下问题；蛋白质的活动性低和缺少含水层。 W0 99/10522A1设及基于磯脂酷胆碱、磯脂酷丝氨酸、磯脂酷己醇胺和銷磯脂的 不同人工膜及用于分析药物化合物结合行为的检验。其公开内容缺少整合至膜中的膜蛋 白。 W0 9610178A1设及一种通过微团或小泡与膜融合将来自微团或小泡的膜蛋白插 入平面状脂质膜的方法，其中融合由可W与微团或小泡共价结合的膜的官能团介导。 US7, 939, 270设及用膜蛋白（如孔蛋白或通道蛋白）探测固体表面上的平面状脂 质膜，因而将该蛋白质插入膜中，并检测插入。US6, 440, 736提供向细胞或细胞膜人工插入 膜蛋白的又一个方法。 CA1243946A1描述一种抗原/脂质体缀合物，其中蛋白质抗原与脂质体小泡的 脂质分子共价结合。W0 01/06007A2提供一种用于研究和表征受体的微泡系统。脂质体小 泡和微泡存在稳定性比固体表面结合的膜低的问题，特别地在操作膜蛋白期间。 W0 2009/117370A1描述了膜包覆的粒子。该膜是包含膜蛋白的天然细胞膜，所述 膜蛋白至少部分地处于如细胞中存在那样的天然取向。将膜包覆的粒子描述为适于高通量 读出、尤其在配体结合测定中适于高通量读出的一批次相似或几乎相同的细胞膜显示器。 但是使用细胞膜（在该种情况下CK)细胞的细胞膜）是耗时的，需要分离生物细胞膜，该可 能在不同目的蛋白的测定中造成对膜组分的不利影响。另外，膜无法在粒子上稳定化，该可 能造成进一步的分析不精确。 US7, 205, 099B2设及一种在包覆到扁平固相支持物上的人工脂质双层中研究钟 离子通道的方法。 W0 2002/072873A1描述了适用于表面等离子体共振光谱法的向传感器表面上固 定蛋白质的过程，其中将脂质膜重构到内嵌预固定化膜蛋白的表面上。通过缓慢移除去垢 剂分子，将膜的脂质分子作为去垢剂悬浮的微团沉积。W0 2010/091293A1中描述了相似的 系统，其中Ag粒子在膜包覆之前进一步沉积到表面上。 W0 2007/122259A1提供表面官能化的金纳米粒子，同时共价连接的间隔分子本 身W立体特异性方式与蛋白质连接，从而确保粒子结合的蛋白质的受控取向。[001引W0 02/056831A2、W0 01/49265A1 和出版物Mirz油ekov等人，化Uire Biotechnology200 (18) : 649-654 (2000)、B油cock等人，JBC276 (42) : 38433-38440 (2001) 和GruiKlner等人，JournalofVirolog}r76(7):3511-3521 (2002)描述了球状或楠球状顺 磁性蛋白脂质体，其含有纯的、天然的和定向的走次跨膜区段免疫原性蛋白，如HIV表面蛋 白、CCR5或CXCR4。免疫原性蛋白借助抗体结合到顺磁粒子上。 Nordlund等人，ACSNANO3(9) (2009) : 2639-2646 设及被脂质双层包封的多孔二 氧化娃粒。在产生脂质包膜的制造期间，二氧化娃粒子用小泡处理，所述粒子与粒子接触时 开放并在粒子上形成一个层。 化arma等人，BioconjugateQiemistry15 (4) (2004) : 942-947 描述了在链霉亲 和素包覆的二氧化娃微球上固定的生物素-PEG3400-细菌视紫红质缀合物。 aiong等人，Langmuir29(1) (201：3) : 299-307 描述 了用阳G接头（即 畑S-PEGsooo-N服）修饰的二氧化娃微球，其中所述阳G接头与膜错定域肤KsA山A山A3K2-FITC 连接。 本专利技术的目的是提供包含膜蛋白的改进模型脂质膜，所述改进的模型脂质膜允许 在膜环境内快速而可靠地检测所述蛋白质的活性。 该目的通过权利要求的主题得W实现。具体地，本专利技术提供一种纳米化或微米化 粒子，所述粒子包含固定到粒子表面上的膜蛋白和一层在膜蛋白之间占据（interspaced) 并包封所述粒子的脂质双层，其中所述膜蛋白通过长度最多5. 5nm的接头分子固定到粒子 表面上。本专利技术和其优选实施方案在权利要求中进一步限定。应当指出，如相对于下文中 的优选实施方案而言所解释那样，可W修改各种结构性组分和参数，其中如本领域技术人 员应当明白，该些实施方案的每一个当然可w与其他优选实施方案组合。 根据本专利技术，发现可W使用膜蛋白作为脂质双层的错定物形成稳定的脂质粒子。[002本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纳米化或微米化粒子，其包含固定到粒子表面上的膜蛋白和一层在膜蛋白之间占据并包封所述粒子的脂质双层，其中所述膜蛋白通过长度最多5.5nm的接头分子固定到粒子表面上。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·瑙曼，C·诺瓦克，
申请(专利权)人：AIT奥地利技术研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT
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