本发明专利技术公开了近红外荧光探针铜纳米簇的合成方法及对糖蛋白的检测方法。它通过“一锅法”合成近红外荧光铜纳米簇，进而用间氨基苯硼酸对已合成的铜纳米簇进行功能化改造，得到能化的铜纳米簇。由于间氨基苯硼酸上的硼酸基团与糖蛋白中顺式二醇的特异性作用，猝灭铜纳米簇荧光强度，该荧光探针能够实现高特异性、高灵敏检测糖蛋白。糖蛋白广泛存在于粘液、血浆、细胞质及细胞膜中，与生物机体有着密切的联系，是一类重要生理活性物质,而且糖蛋白与某些遗传疾病密切相关，所以检测糖蛋白是具有很重要的实际意义的。
【技术实现步骤摘要】
近红外荧光探针铜纳米簇的合成方法及其应用本专利受到国家自然科学基金面上项目21375095、全国优秀博士学位论文作者专项资助资金FANEDD-201023、天津市应用基础研究计划重点项目12JCZDJC21700和天津市“131”创新型人才培养工程第一层次项目ZX110185的资助。
本专利技术属于生物分析检测
，涉及一种近红外荧光探针铜纳米簇的“绿色”合成方法和对其功能化以及功能化后的铜纳米簇对糖蛋白检测的应用。
技术介绍
金属纳米簇是光致发光的半导体纳米团簇，主要有金纳米簇，银纳米簇，铂纳米簇及铜纳米簇等。金属纳米团簇是由Au、Ag、Pt等金属的几个至几十个原子组成的具荧光、水溶性的分子级聚集体。相比金纳米簇，银纳米簇和铂纳米簇，铜纳米簇具有资源丰富，成本低廉，可广泛应用于企业等优点。铜纳米簇的直径在～2nm左右，自铜纳米簇被发现以来，由于其具有独特的荧光性质，无毒性，尺寸较小且均匀，水溶性好现已广泛应用于检测各种负离子、重金属离子和生物小分子。然而，铜纳米簇在分析检测糖蛋白方便得到关注较少。糖蛋白，由寡糖链与肽链中的一定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的一类重要的生理活性物质，存在于粘液、血浆、细胞膜及细胞间质中。糖蛋白有着各种功能，尤其在生物体系中更为重要。糖蛋白的功能不仅仅是作为细胞外基质的结构成分起支持、连接及缓冲作用，更重要的是参与细胞的识别、粘着及迁移，物质转运，信息传递，神经传导，并调控细胞的增殖及分化。而且糖蛋白与很多疾病如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病、糖尿病以及某些遗传性疾病等的发生、发展有关。再者，肿瘤细胞表面的糖蛋白可整个地或部分地脱落，进入血循环，可以作为异常的标志为临床诊断提供信息，因此可用于临床诊断及病情监测。因此，对于糖蛋白的研究具有十分重要的生物学意义和临床应用价值，目前已成为蛋白质组学研究的活跃领域。目前选择性分离富集糖蛋白的方法主要有凝集素亲和技术、肼腙化学反应法、硼酸亲和色谱、亲水作用法、免疫亲和色谱法、体积排阻法等。这些方法存在检测时间长、检测过程复杂、仪器昂贵等不足，本专利技术利用具有独特的光学性质的功能化后的铜纳米簇和糖蛋白中硼酸基团之间的亲合作用，检测体系中的糖蛋白，可通过反应体系荧光光谱变化实现对糖蛋白的快速灵敏检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种水溶的、无毒性的、荧光寿命长的、易储存的、近红外的荧光铜纳米簇合成方法且在室温下利用荧光强度变化对溶液中糖蛋白的操作简单、反应快速、成本低廉、高灵敏度和高选择性的检测方法。为实现上述目的，本专利技术公开了一种“一锅法”绿色合成近红外荧光铜纳米簇（APBA-CuNCs）的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）铜纳米簇的制备：称取60-160mg牛血清蛋白（BSA）溶解于装有10mL高纯水的烧杯中，用移液枪取250μL氯化铜溶液（0.1M）注入溶液中，室温搅拌；此时溶液呈现白色水凝胶的状态，是由于铜离子和牛血清蛋白（BSA）上的–NH,–OH,和–SH基团间的配位。待体系反应20-30min，用移液枪移取0.2-1.5mL水合肼（80%）慢慢注射到反应体系中，快速补水至40mL,再在室温搅拌5h，待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇的生成。（2）纯化：用透析袋（截留分子量6000-8000，直径25mm）对制得铜纳米簇进行纯化，每4h换一次高纯水，透析24h。待透析完成后将纯化的铜纳米簇真空35℃干燥，得到在330nm光的激发下，发射在620nm近红外区域的荧光铜纳米簇。（3）功能化：①将真空干燥得到的铜纳米簇溶于40mL高纯水中（浓度为1mg/mL）；②称取10-30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5-15mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于5mL高纯水中，待溶解后，向溶液中加入10-30mg间氨基苯硼酸（APBA），室温搅拌1h，活化间氨基苯硼酸上的氨基；③加入向活化体系加入3-8mL铜纳米簇（1mg/mL），室温下搅拌4h；④待体系反应结束，将溶液在室温下5000rpm离心，除去未反应的间氨基苯硼酸；⑤上清液放入透析袋中透析,每4h换一次高纯水，透析24h，得到间氨基苯硼酸功能化的铜纳米簇（APBA-CuNCs）。本专利技术进一步公开了近红外荧光探针铜纳米簇合成方法及其检测溶液中糖蛋白方面的应用。实验结果显示：（1）本专利技术所提供的检测方法有较宽的检测范围和较低的检出限。（2）本专利技术利用铜纳米簇检测卵清蛋白过程简单，易于操作。（3）本专利技术采用荧光检测，非常直观，非常方便，有利于今后的推广。本专利技术更进一步公开了采用近红外荧光探针铜纳米簇合成方法及其对溶液中糖蛋白进行检测的方法：（1）0.1mol/L，25℃，pH=7.4PBS缓冲溶液的配置：0.2mol/LNa2HPO4溶液称取0.716gNa2HPO4·12H2O溶于10mL高纯水中；0.2mol/LNaH2PO4溶液称取0.312gNaH2PO4·2H2O溶于10mL高纯水中；取1.9mLNaH2PO4溶液和8.1mLNa2HPO4溶液，定容到20mL（0.02mol/L），保存于冰箱中，用时稀释至0.01mol/L；（2）一系列浓度OB（卵清蛋白）溶液配置：2.0μmol·L-1OB溶液：称取0.0009g卵清蛋白溶于高纯水中，定容10.0mL；以2.0μmol·L-1OB溶液稀释配制10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、110nM、120nM、130nM、140nM、150nM、160nM、170nM的OB溶液；（3）铜簇检测卵清蛋白：移取0.01mol/LPBS溶液3.9mL，加入50-100μL功能化后的铜纳米簇，再加入20μL卵清蛋白，用荧光光度计检测荧光强度，根据其荧光强度的变化检测卵清蛋白的量。（1）称取60-160mg牛血清蛋白（BSA）溶解于装有10mL高纯水的烧杯中，用移液枪取0.25mL氯化铜溶液（0.1mol/L）注入溶液中，室温搅拌30min。由于铜离子和牛血清蛋白上的–NH,–OH,和–SH基团间的配位，溶液呈现白色水凝胶的状态。（2）待体系反应30min，用移液枪吸取0.2-1.5mL水合肼（N2H4·2H2O）（wt=80%）慢慢注射到反应体系中，快速补水至40mL,再在室温搅拌5h。待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇生成。用透析本专利技术的优点和积极效果：（1）本专利技术公开了一种用水合肼作还原剂的铜纳米簇制备方法，此制备方法制得的铜纳米簇具有良好水溶性好、无毒性、尺寸较小且均匀，在水溶液中且较为稳定。（2）本专利技术所提供的制备方法制备的铜纳米簇制备具有良好的生物相容性，形成一种近红外荧光探针。（3）本专利技术合成出的铜纳米簇可以发展成为一种指示生物体系糖蛋白的近红外荧光探针。并将其应用于实际样品中，根据铜纳米簇的荧光强度检测出样品中的糖蛋白含量。（4）本专利技术利用间氨基苯硼酸与糖蛋白上的顺式二醇的亲和作用，在室温下对溶液中的糖蛋白简单、快速、经济、灵敏和高选择性的检测方法。用于检测糖蛋白的线性范围为5-170nM，检出限为2.0nM。附图说明：图1为功能化后铜纳米簇的TEM图，说明铜纳米簇已经成功被合成；图2为铜纳米簇及功能化后铜纳本文档来自技高网...
【技术保护点】
近红外荧光探针铜纳米簇的合成方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）铜纳米簇的制备：称取60‑160 mg牛血清蛋白溶解于装有10 mL高纯水的烧杯中，用移液枪取250 μL氯化铜溶液（0.1 M）注入溶液中，室温搅拌；待体系反应30 min，用移液枪移取0.2‑1.5 mL 80 %水合肼（w/w）慢慢注射到反应体系中，快速补水至40mL,再在室温搅拌5 h，待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇的生成；（2）纯化：用截留分子量6000‑8000，直径25 mm透析袋对制得铜纳米簇进行纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇真空35℃干燥，得到在330 nm光的激发下，发射在620 nm近红外区域的荧光铜纳米簇；（3）功能化：①将真空干燥得到的铜纳米簇溶于40 mL高纯水中（浓度为1 mg/mL）；②称取10‑30 mg 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和5‑15 mg N‑羟基琥珀酰亚胺溶于5 mL高纯水中，待溶解后，向溶液中加入10‑30 mg 间氨基苯硼酸，室温搅拌1 h，活化间氨基苯硼酸上的氨基；③向活化体系加入3‑8 mL铜纳米簇（1 mg/mL），室温下搅拌4 h；④待体系反应结束，将溶液在室温下5000 rpm离心，除去未反应的间氨基苯硼酸；⑤上清液放入透析袋中透析,每4 h换一次高纯水，透析24 h，得到间氨基苯硼酸功能化的铜纳米簇。...
【技术特征摘要】
1.近红外荧光探针铜纳米簇的合成方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）铜纳米簇的制备：称取60-160mg牛血清蛋白溶解于装有10mL高纯水的烧杯中，用移液枪取250μL，0.1M氯化铜溶液注入溶液中，室温搅拌；待体系反应30min，用移液枪移取0.2-1.5mL80%（w/w）水合肼慢慢注射到反应体系中，快速补水至40mL,再在室温搅拌5h，待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇的生成；（2）纯化：用截留分子量6000-8000，直径25mm透析袋对制得铜纳米簇进行纯化，每4h换一次高纯水，透析24h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇真空35℃干燥，得到在330nm光的激发下，发射在620nm近红外区域的荧光铜纳米簇；（3）功能化：①将真空干燥得到的铜纳米簇溶于40mL高纯水中，浓度为1mg/mL；②称取10-30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5-15mgN-羟基琥珀酰亚胺溶于5mL高纯水中，待溶解后，向溶液中加入10-30mg间氨基苯硼酸，室温搅拌1h，活化间氨基苯硼酸上的氨基；③向活化体系加入3-8mL铜纳米簇，室温下搅拌4h；④待体系反应结束，将溶液在室温下5000rpm离心，除去未反应的间氨基苯硼酸；⑤上清液放入透析袋中透析,每4h换一次高纯水，透析24h，得到间氨基苯硼酸功能化的铜纳米簇。2.权利要求1所述近红外荧光探针铜纳米...
【专利技术属性】
技术研发人员：李妍，张菲，李欣格，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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