本发明专利技术涉及一种具镇痛活性多肽的筛选方法，属于基因工程领域；具体筛选方法操作如下：首先根据ω-MⅦA类knottin成员GsGUR、MdPOI的氨基酸序列，推导其编码基因序列，并优化GsGUR、MdPOI基因的密码子；合成优化的相关基因后，连接到原核表达载体，将得到的重组质粒分别导入大肠杆菌Origami（DE3）菌株，将得到的基因工程菌株分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基，震荡培养，经IPTG诱导后，产生可溶性重组蛋白；分离纯化后，得到重组活性多肽GsGUR、MdPOI；并通过小鼠醋酸扭体法首次证实重组GsGUR、MdPOI具有镇痛活性，本发明专利技术拓展了镇痛多肽的来源，为镇痛多肽的筛选提供了新的思路和技术手段；有望从相关植物和昆虫中工业化提取天然的镇痛多肽，满足药物研发及临床需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于基因工程领域。
技术介绍
芋螺毒素是由海洋软体动物芋螺(Conus)分泌的一类用于自卫和捕食的活性肽类毒素。芋螺毒素分子质量小，通常由10-30个氨基酸残基组成，大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。芋螺毒素种类繁多，一级结构多变，但信号肽及前导肽序列相对保守。芋螺毒素能特异性地作用于体内多种(钾、钠、钙等)离子通道、细胞膜上的各种神经递质和激素的受体，从而干扰细胞或神经中的信号传递。因此，在治疗慢性疼痛、急性疼痛、癫痫、神经保护、心血管疾病、精神失常、运动失调、痉挛症、癌症及中风等方面具广泛应用前景。ω-芋螺毒素M VE A (ω-MVEA)是从幻芋螺毒液中分离出的多肽类神经毒素，其氨基酸序列为CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC* (其中C端*表示酰胺化修饰)，含有三个链内二硫键(Cys1-Cys 16，Cys8_Cys20，Cys 15_Cys25)。ω -Μ VIIA 能可逆地阻断 N 型妈离子通道，从而阻止疼痛信号的传导。2004年，美国食品与药物管理局(FDA)正式批准以ω-MVEA为有效成分的Ziconotide (商品名Prialt?)，作为一种治疗慢性疼痛的特效镇痛药。临床试验表明，Ziconotide具有无耐药性和成瘾性等优点，对癌症、脊柱损伤、丘脑损伤等引起的严重慢性疼痛都有显著的镇痛效果。作为药物，ω-MVEA主要是依赖于芋螺的天然毒液的提取。但是，由于芋螺中芋螺毒素含量低，且大量采集海洋生物也不利于保持生态平衡。因此，利用经典的生化提取的方法直接从芋螺中分离芋螺毒素已经难以满足研宄和药物生产的需要，从而使芋螺毒素的深入研宄及开发受到一定限制。许多科学家希望采用多肽固相合成的方法来解决这一困难，其技术路线是通过分离天然芋螺毒素后测序或采用基因克隆方式获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素。但是，由于芋螺毒素结构复杂，用化学合成的方法获得ω-MVEA比较困难，且成本很高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。同时，也有科学家提出可将芋螺毒素的基因转化到大肠杆菌或酵母等微生物中表达(Zhan Jj Chen X，Wang C，Qiu Jj Ma F，Wang K，and Zheng S.A fus1n protein ofconotoxin MVIIA and th1redoxin expressed in Escherichia coli has significantanalgesic activity.B1chemical and B1physical Research Communicat1n.2003，311: 495-500.)，但芋螺毒素的氨基酸序列短，后期分离纯化比较困难，且翻译后修饰复杂，在微生物表达系统中无法解决C端酰胺化的问题，不能获得高活性的重组芋螺毒素。由于上述因素，极大地限制了 ω-MVEA在临床上的应用。因此，从其他动物、植物资源(而不仅是芋螺资源)发掘具有镇痛活性的多肽是解决上述问题的重要途径。ω-MVEA具有保守的抑制剂半胱氨酸结(inhibitor cystine knot，ICK)，属于ICK家族，也叫knottin家族。ICK家族广泛存在于芋螺、蜘蛛、昆虫等动物中，也存在于一些植物中。在knottin 数据库(the KNOTTIN database，http://knottin.cbs.cnrs.fr)中，现已有 2193个成员。经生物信息学分析发现，其中有1574个成员的二硫键骨架与ω-MVEA完全一致，可能具有潜在的镇痛活性。本专利技术将这类多肽称为ω-MVEA类knottin (ω-MVEA-likeknottin)。在大肠杆菌表达系统中，pET_32a载体上的Trx蛋白有利于二硫键的形成，而经遗传改造的大肠杆菌Origami (DE3)菌株的细胞内为氧化状态，也有助于二硫键的形成。因此，本专利技术借助基因工程手段，在大肠杆菌pET-32a/0rigami (DE3 )表达系统中，实现了具三对二硫键的0^'/114类1010?丨11成员68^1?、1(^01的高效可溶性表达，并通过小鼠醋酸扭体试验证实这些重组多肽具有显著的镇痛活性。本专利技术利用基因工程方法从ω-MVEA类knottin中发掘具有镇痛活性的多肽，为筛选镇痛多肽提供了新的思路和技术手段。Gs⑶R来源于匙羹藤，MdPOI来源于家蝇，由于匙羹藤等植物易于大规模种植，家蝇等昆虫也易于大量饲养，所以有望从这些植物、昆虫中工业化提取镇痛多肽，满足药物研发及临床需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，而公开。本专利技术采用以下技术方案以达到上述目的: 由于ω-MVEA类knottin与ω-芋螺毒素MVEA具有共同的二硫键骨架，所以ω-MVEA类knottin具有潜在的镇痛活性。具体筛选方法如下:(1)根据ω-MVEA 类 knottin 成员 Gs ⑶ R (GenBank ID:AAB22380)、MdP0I ( GenBankID:P81765)的氨基酸序列，推导其编码基因序列，并根据大肠杆菌密码子使用频率优化Gs⑶R、MdPOI基因的密码子； (2)合成优化的相关基因后，连接到原核表达载体pET-32a，得到重组质粒pET-32a-Gs⑶R和pET-32a_MdP0I，然后将重组质粒分别导入大肠杆菌0rigami(DE3)菌株，得到基因工程菌 Origam1-GsGUR 和 Origam1-MdPOI。(3)将Origam1-Gs⑶R和Origam1-MdPOI菌株分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基，震荡培养，经IPTG诱导后，可高效产生可溶性重组蛋白； (4)采用镍离子亲和层析分离纯化重组蛋白，得到重组活性多肽Gs⑶R、MdP0I。采用小鼠醋酸扭体法证实，重组Gs⑶R、MdPOI均具有显著的镇痛活性。本专利技术的有益效果: 本专利技术借助基因工程手段从ω-MVEA类knottin中发掘具有镇痛活性的多肽，首次证实重组Gs⑶R、MdP0I具有镇痛活性，其中Gs⑶R来源于植物匙羹藤，MdPOI来源于家蝇，因此本专利技术拓展了镇痛多肽的来源，为镇痛多肽的筛选提供了新的思路和技术手段。海洋芋螺资源有限，这极大地限制了芋螺毒素的应用，然而像Gs⑶R、MdP0I这些ω -M VE A类knottin来源于易于栽培的植物或易于人工饲养的昆虫，所以有望从相关植物和昆虫中工业化提取天然的镇痛多肽，满足药物研发及临床需求。【附图说明】图1:代表性ω -M YE A类knottin的多序列比对结果。黑色阴影所示为6个保守的半胱氨酸，序列上方三组线条所示为三对二硫键形成方式。图2:重组载体上Gs⑶R、MdP0I基因的测序鉴定结果。A图中所示为Gs⑶R基因测序峰，划线部分依次为限制性内切酶酶切位点BamHI和HindIII。B图中所示为MdPOI基因测序峰，划线部分依次为限制性内切酶酶切位点HindIII和BamHI，图中为MdPOI基因反向互补序列。图3:重组 GsGUR、MdPOI 的电泳检测结果。M:蛋白质 marker，I:Origarn1-GsGUR菌株IPTG诱导前，Origam1-Gs⑶R菌株2_4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种镇痛活性多肽的筛选方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）根据ω‑MⅦA类knottin成员GsGUR、MdPOI的氨基酸序列，推导其编码基因序列，并对GsGUR、MdPOI基因序列进行优化；（2）优化后合成基因序列，连接到原核表达载体pET‑32a，得到重组质粒pET‑32a‑GsGUR和pET‑32a‑MdPOI，然后将重组质粒分别导入宿主菌，分别得到相应基因工程菌；（3）将得到的基因工程菌株分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基，震荡培养，经IPTG诱导后，可高效产生可溶性重组蛋白；（4）采用镍离子亲和层析分离纯化重组蛋白，得到重组活性多肽GsGUR、MdPOI。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何华纲，朱姗颖，楚鹰，李云亮，马海乐，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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