本发明专利技术公开一种猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的TaqMan探针；针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的引物对。本发明专利技术基于a1基因的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏性高、重复性好的特点，可快速、准确、高通量地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体，可应用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等方面，对于猪的附红细胞体病的早期快速诊断、防控和净化具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物血液中支原体感染检测
，具体涉及一种猪源附红细胞体 荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。
技术介绍
猪源附红细胞体属于不能体外培养的嗜血支原体家族中的成员，一般寄生在猪红 细胞的表面、血浆和骨髓。猪源附红细胞体感染在全世界广泛分布，给养猪业带来严重的 经济损失。其急性感染可导致严重的菌血症、急性红细胞溶血，有时可导致年轻仔猪死亡、 怀孕母猪流产等。对于慢性感染的猪只，血液中细菌含量低，临床症状多变，比如可能出现 温和的黄疸、亚健康、生长速度缓慢、生产能力低下或对其他的感染性疾病易感。在强烈的 免疫作用和抗生素治疗之下，猪源附红细胞体依旧可以在宿主体内建立慢性和持续性的感 染。猪感染附红细胞体后，极有可能在症状消失后转化为慢性感染。目前发现感染猪的附 红细胞体（即猪源附红细胞体）有两种，包括猪附红细胞体（Mycoplasma suis)和小附红细 胞体（M. parvum)。由于依靠 16S rRNA基因及Rnase P RNA序列的分子鉴定方法才出现不 久，对小附红细胞体的研究尚不充分。 目前应用于猪附红细胞体病的检测方法有多种，包括镜检、血清学检测、PCR等。而 临床上该病的诊断最初主要以镜检为主，包括鲜血压片和涂片染色镜检。由于附红细胞体 主要寄生在红细胞表面和血浆中，常导致红细胞变形。但红细胞的变形可以由多种因素引 起，如涂片技术、渗透压的改变等，因此许多人容易将变形红细胞错误判断为附红细胞体感 染，从而导致误诊，因此直接涂片和悬滴法不宜作为确诊方法，只能视为疑似病例。检测慢 性感染的最有效方法是接种脾切除的动物，观察其是否发病，但该方法费时、费力，也不适 合常规检测。 血清学方法包括采用间接血凝试验（Indirect Hemagglutination Assay, IHA)、 补体结合试验（complement fixation test, CFT)或酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测抗体等，其中ELISA方法的敏感性很高，取得了不错进 展。但由于猪附红细胞体至今不能进行体外培养，抗原及抗体的获得难度较大，限制了血清 学诊断方法的发展和使用，至今该类方法尚未能真正在临床上得到应用（Hoelzle et al.， 2006)。 近几年虽然用PCR方法诊断猪附红细胞体病的报道屡见不鲜，但常用于种型鉴定 的基于16S rRNA基因的PCR技术非特异性扩增十分严重，同时需要进行电泳分离及染色处 理，且不能准确定量，故使其应用受到限制。1995年，美国TPeTrkinElmer公司研制成功具 有革命性意义的荧光定量PCR技术，它在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累 积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定时分析，可以利用质粒标 准品作为模板直接计算样品DNA中的附红细胞体的拷贝数。荧光定量PCR具体包括2大类， 即探针类和染料类方法。相比SYBR Green I等染料类定量方法，探针类方法因为利用与靶 序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，具有更高的特异性。其主要代表是TaqMan探 针法。目前基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR (TaqMan real-time PCR)检测猪源附红 细胞体的方法报道的还很少，2008年闻若潜、吴志明等人根据GenBank中猪附红细胞体推 测的功能性基因 ORF2序列设计引物和TaqMan探针，建立了猪附红细胞体的TaqMan荧光定 量PCR检测方法。但由于该基因很难进行后续PCR扩增、种型鉴定及蛋白表达，所以没有得 到广泛应用。2013年，曹薇等人建立了基于猪附红细胞体gl基因的TaqMan实时荧光定量 PCR，用于800多份田间样品的检测，并与普通PCR结果相比较，证明其具有良好的特异性、 敏感性及重复性。但是，其特异性和敏感性可能还有待进一步提高。 猪附红细胞体DnaK样蛋白热休克蛋白Al (heat shock proteins Al, HspAl)定 位在猪附红细胞体胞浆及胞膜上，具有表面可接触性、ATP酶（ATPase)活性及抗原性，可能 参与对宿主红细胞的黏附，该HspAl蛋白的编码基因被命名为猪附红细胞体al基因。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于al基因的猪源附红细胞体荧光定量 PCR检测试剂盒，由于al基因具有比gl基因更稳定、更保守的遗传特性，本专利技术基于al基 因的猪源附红细胞体检测试剂盒比之前基于gl基因的检测试剂盒特异性更强、灵敏性更 高，可快速、准确地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体。 为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现： 在本专利技术的一个方面，提供了一种猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，该 试剂盒包括： 针对SEQ ID NO: 1所示猪附红细胞体al基因序列设计的TaqMan探针，该探针与所 述猪附红细胞体al基因序列第45~191位、第360~532位、第534~631位、第684~ 811位、第1038~1141位、第1143~1234位、第1236~1363位、或第1371~1462位的 核苷酸序列特异性结合； 针对SEQ ID NO: 1所示猪附红细胞体al基因序列设计的引物对，该引物对用于 扩增所述猪附红细胞体al基因序列第45~191位、第360~532位、第534~631位、第 684~811位、第1038~1141位、第1143~1234位、第1236~1363位、或第1371~1462 位的核苷酸序列。 优选的，所述探针与SEQ ID NO: 1序列第360~532位的核苷酸序列特异性结合； 所述引物对用于扩增SEQ ID NO: 1序列第360~532位的核苷酸序列。 更优选的，所述探针与SEQ ID NO: 1序列第360~484位的核苷酸序列特异性结 合；所述引物对用于扩增SEQ ID NO: 1序列第360~484位的核苷酸序列。 在本专利技术的一个优选实施例中，所述探针的序列如SEQ ID N0:6所示；所述引物对 的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。 所述试剂盒还包括：含有猪附红细胞体al基因的阳性重组质粒标准品。优选的， 该阳性重组质粒是将长度为1657bp的猪附红细胞体al基因插入pMDIS-T载体而制得。 所述试剂盒还包括：突光定量PCR反应缓冲液及聚合酶。 所述探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有淬灭基团。 在本专利技术的另一方面，还提供了上述猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒在 制备诊断猪的附红细胞体病的产品中的应用。 本专利技术基于al基因的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强、 灵敏性高、重复性好的特点，可快速、准确、高通量地检测出猪血样品中是否存在附红细胞 体，可应用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等方 面，对于猪的附红细胞体病的早期快速诊断、防控和净化具有重要意义。【附图说明】 下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术作进一步详细的说明。 图1是本专利技术实施例1的猪附红细胞体al基因的PCR扩增电泳图； 图2是本专利技术实施例1的重组质本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的TaqMan探针，该探针与所述猪附红细胞体a1基因序列第45～191位、第360～532位、第534～631位、第684～811位、第1038～1141位、第1143～1234位、第1236～1363位、或第1371～1462位的核苷酸序列特异性结合；针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的引物对，该引物对用于扩增所述猪附红细胞体a1基因序列第45～191位、第360～532位、第534～631位、第684～811位、第1038～1141位、第1143～1234位、第1236～1363位、或第1371～1462位的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈兆国，王向佩，周鹏，米荣升，黄燕，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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