HIV-1整合酶突变体库的构建法制造技术

本发明专利技术公开了一种HIV-1整合酶突变体库的构建法，包括如下内容：(1)、利用转座子的转座，以及转座子两端限制性内切酶在目的基因随机位点制造空隙，插入突变插入盒，再利用盒上的限制性内切酶位点，通过酶切自连，实现目的基因上3个碱基的替换，目的基因翻译成蛋白后，造成目的蛋白上一个或连续两个氨基酸的突变；(2)、利用定点突变PCR，使突变插入盒上的用于替换原目的基因3个碱基的3个碱基，由编码半胱氨酸的密码子突变为编码其他19个氨基酸的密码子，从而来增加最终突变库的多样性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于艾滋病治疗药物的开发设计领域，构建的整合酶突变体库可以用来筛 选对Hiv-I整合酶有抑制作用的药物。
技术介绍
高效抗病毒疗法（HAART)是目前FDA批准的治疗AIDS的标准方案，但至今始终没 有治愈的案例。同时，因疫苗大都可能只有预防而无治疗功能；即使使用疫苗，大部分当今 的HIV-I感染者最终还是会发展成为艾滋病患者。因此，开发新的化学药物来阻止病情的 发展意义重大。 整合酶（IN)是HIV-I复制必需的三个基本酶之一，在其生活史中扮演了重要角 色。目前，雷特格韦和埃替格韦是仅有的两种经过FDA通过的针对IN的药物。而其它现有 的30多种获批HIV抑制剂主要都是针对逆转录酶和蛋白酶设计的。由于作用靶点不同，IN 抑制剂不受目前大多数的因化疗所产生的耐药性影响。且IN的序列只存在于病毒中，哺乳 动物均无对应酶，所筛选到的抑制剂在治疗中将会更加安全、有效。因此，IN成为十分有前 景的抗HIV药物设计的新靶标。 临床观察显示，对新药的耐药性引起的病情变化进行分析至关重要。这需要多年 的临床研宄和细致的统计分析。研宄发现，一些IN突变体对于正在进行临床实验或已经上 市的IN抑制剂具有耐受性。这些信息的获得对于目前IN抑制剂的结构修饰以及未来合理 有效的开发新IN抑制剂有着重要意义。但这样的筛选过程耗时耗力，且覆盖的范围十分有 限，所花费的总经费也不少。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种运用TDEM(转座子导向的碱基替换突变方 法）来开发一个饱和的具有高分辨率的突变库，以解决常规突变方法效率及覆盖率低或者 特异性好但分布不均等不足。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种HIV-I整合酶突变体库的构建法，包括 如下内容： (1)、利用转座子的转座，以及转座子两端限制性内切酶在目的基因随机位点制造 空隙，插入突变插入盒（预先设计的），再利用盒上的限制性内切酶位点，通过酶切自连，实 现目的基因上3个碱基的替换，目的基因翻译成蛋白后，造成目的蛋白上一个或连续两个 氨基酸的突变； (2)、利用定点突变PCR，使突变插入盒上的用于替换原目的基因3个碱基的3个碱 基，由编码半胱氨酸的密码子突变为编码其他19个氨基酸的密码子，从而来增加最终突变 库的多样性。 备注说明：其他19个氨基酸的密码子，具体如下： GCC，丙氨酸；CGC，精氨酸；AAC，天冬酰胺；GAT，天冬氨酸；CAG，谷氨酰胺；GAA，谷 氨酸；GGC，甘氨酸；CAT，组氨酸；ATC，异亮氨酸；CTG，亮氨酸；AAA，赖氨酸；ATG，甲硫氨酸； TTT，苯丙氨酸；CCA，脯氨酸；AGC，丝氨酸；ACC，苏氨酸；TGG，色氨酸；TAC，酪氨酸；GTG，缬 氨酸。 作为本专利技术的HIV-I整合酶突变体库的构建法的改进，包括如下步骤： -、质粒的构建： 1)、质粒pCompact-Kana-IN的构建，包括以下步骤： ① 、质粒 pCompact-Kana 的构建： 片段Origin和片段Kanamycin R，由T4DNA连接酶催化连接得到质粒 pCompact-Kana ； ②、质粒 pCompact-Kana-IN 的构建： 以pCompact-Kana为模板，扩增获得载体片段； 整合酶片断和载体片段由T4DNA连接酶催化连接，得质粒pCompact-Kana-IN ; 2)、质粒pMutationinsert的构建，包括以下步骤： ①、Zeocin片段和Origin片段，由T4DNA连接酶催化连接； ②、PCR扩增质粒stuffer部分； ③、以上述步骤①的连接产物为模板进行PCR，得到Origin和Zeocin两个片段的 连接片段； ④、以步骤③扩增所得的片段、步骤②所得的stuffer片段，由T4DNA连接酶催化 连接，得到质粒pMutationinsert ; 3)、质粒pFrameCheck的构建，包括以下步骤： ①、片段载体部分（pCompact-Kana)，E. coli乳糖启动子（Plac)，丝状菌体fd 次要衣壳蛋白的gill信号序列（gill)，填充基因（stuffer)，以及β -内酰胺酶基因 (Amp-R)分别进行PCR反应扩增； ②、5个片段依次连接；得质粒pFrameCheck ; 二、转座子导向的碱基替换突变方法： 1)、转座反应： 为了表达Nd-MuA，包含Nd-MuA的质粒通过转化进入E. coli BL21(DE3) RIL感受态 细胞中，诱导Nd-MuA的表达； 再利用纯化后的Nd-MuA催化Mu转座子转座进入包含目的基因 HIV-I整合酶基因 的质粒 pCompact-Kana-IN 中； 2)、去除转座子插入质粒载体的转座； 得到转座子插到整合酶的转座产物； 3)、去除转座子： 用NotI酶切步骤2)得到的转座产物，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收大片段 (即，满足2. 7kb大小的片段），将得到整合酶随机位置断开的线性DNA ; 4)、插入MI替代转座子： 片段Zeocin，NNN以及stuffer片段组成了 MI片段； 用T4DNA连接酶将所述线性DNA和MI片段连接； 5)、BsgI 去除 MI 右臂： BsgI酶切上述步骤4)得到的质粒，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收大片段 (即，大小为3. Ikb的片段）； 并使得BsgI酶切后片段5'端突出末端补平或3'端突出末端削平，然后将所得产 物用T4DNA连接酶（Takara)自连； 6)、BpmI 去除 MI 左臂： BpmI酶切上述步骤5)得到的质粒，得到含有突变整合酶基因的质粒；从而获得突 变分布均匀，且多样的突变库。 备注说明： 该质粒包含用NNN替代了整合酶基因上随机3个碱基的突变体； 如果该步骤无法获得本专利技术所希望的结果时，可返回至步骤1)的转座反应，重新 进行操作，直至能获得一个突变分布均匀，且多样的突变库为止。 作为本专利技术的HIV-I整合酶突变体库的构建法的进一步改进，还包括如下步骤： 三、利用pFramecheck质粒，剔除有移码突变及终止密码子的突变。 作为本专利技术的HIV-I整合酶突变体库的构建法的进一步改进： 所述步骤三包括以下步骤： (I)、BsaI酶切质粒pFramecCheck，割胶回收大片段（即，大小为2. 9kb的片段）， 从而得到去除IacZa基因的线性片段； ⑵、BsaI酶切所述含有突变整合酶基因的质粒，割胶回收0. 9k的整合酶突变基 因； (3)将步骤（1)和步骤⑵得到的片段在T4DNA连接酶的催化下连接，转化到 E. coli DH5 α菌株化学感受态细胞中，涂布在含有50 μ g/ml卡那霉素和50 μ g/ml氨苄青 霉素的LB固体培养基上；从而使所得的质粒去除了含有移码突变或终止子的突变。 即，本专利技术通过构建一个饱和的、高分辨率的整合酶突变体库，来解决药物筛选过 程中遇到的问题。 本专利技术的主要特点在于：（1)本专利技术使用MuA转座酶催化转座子插入整合酶 基因，为了筛选到耐药的少数病毒株，最理想的情况是目的片段的每一个碱基都发生突 变，商业MuA转座酶的位点偏好性不能满足这一点，有研宄发现N端缺失的MuA转座 酶（N-terminally deleted MuA tr本文档来自技高网...

【技术保护点】
HIV‑1整合酶突变体库的构建法，其特征是包括如下内容：(1)、利用转座子的转座，以及转座子两端限制性内切酶在目的基因随机位点制造空隙，插入突变插入盒，再利用盒上的限制性内切酶位点，通过酶切自连，实现目的基因上3个碱基的替换，目的基因翻译成蛋白后，造成目的蛋白上一个或连续两个氨基酸的突变；(2)、利用定点突变PCR，使突变插入盒上的用于替换原目的基因3个碱基的3个碱基，由编码半胱氨酸的密码子突变为编码其他19个氨基酸的密码子，从而来增加最终突变库的多样性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周亚夫，杨立莉，沈学彬，叶剑，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33