本发明专利技术涉及基于抗体的双靶向分子，并且涉及用于产生这类双靶向分子的方法，包括基于文库的方案。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基于抗体的双靶向分子，并且涉及用于产生这类双靶向分子的方法， 包括基于文库的方案。 专利技术背景 本专利技术涉及双特异性抗体或其功能片段的新设计。 在文献中，已经报道了产生双特异性抗体分子的多种方案。这些方案可以分成两 类：1)产生双特异性抗体样式，其中识别两个靶或两个表位的两个互补位均位于一个互补 性VH-VL对形成的一个异二聚抗体可变区内部并且均包含属于这个互补性VH-VL对的⑶R 残基，和2)产生其他双特异性抗体样式，其中识别两个靶或表位的两个互补位不是都位于 一个互补性VH-VL对形成的一个异二聚抗体可变区内部并且不是都包含属于同一个互补 性VH-VL对的CDR残基。 在第一类方案内部，已经在文献中描述了可预测地工程化双特异性抗体分子的仅 两种方法，并且这些方法将在下文至部分中详细讨论。然而，考虑这项工作 的背景，将首先总结第二类方案。 这种第二类方案（其中识别两个靶或表位的两个互补位不是都位于一个互补性 VH-VL对形成的一个异二聚抗体可变区内部并且不是都包含属于同一个互补性VH-VL对的 CDR残基）构成了非常庞大的由各种现有技术人员从事的工作，并且已经描述了这类双特 异性抗体的众多不同例子。 在属于第二类方案中的第一组例子中，具有不同特异性的两种或更多种抗体片段 (包括Fab片段、单链Fv或单结构域抗体）通过化学键接或通过遗传融合借助一种或多种 肽接头组合。在这组例子中公开的双特异性抗体样式包括以下： a. 双体抗体（Perisic 等人，Structure. 1994 Dec 15 ;2 (12) :1217-26; Kontermann, Acta Pharmacol Sin.2005 Jan ；26 (I):1-9 ；Kontermann, Curr Opin Mol Ther. 2010 Apr ; 12 (2):176-83)。 b. TandAb 等（Cochlovius 等人，Cancer Res. 2000 Aug 15 ;60 (16) :4336-41)。 c. 通过肽接头以遗传方式融合的对不同靶特异的单结构域（例如Domantis :W0 2008/096158 ；Ablynx ：W0 2007/112940) d. 其他（综述参见：Enever 等人，Curr Opin Biotechnol. 2009 Aug ;20(4) :405-11. Epub 2009 Aug 24 ;Carter, Nat. Rev. Immunol. 6,343(2006) ;P.Kufer 等人，Trends Biotechnol. 22, 238(2004)) 〇 为了改善它们在医学应用中的潜在用途，可以使用多种技术延长上述双特异性抗 体样式的体内血清半寿期，所述技术包括以下： a. 添加血清白蛋白或血清白蛋白结合实体 b. PEG 化 C.通过遗传融合如HAP化添加蛋白质聚合物（Schlapschy等人，Protein Eng Des Sel. 2007 Jun ;20(6):273-84 Epub 2007 Jun 26)或 XTEN(Schellenberger, Nat. Biotechnology 12 (2009) 1186)〇 在这组例子中，双特异性抗体包含缺少Fe区的抗体片段，并因此通常不显示与新 生Fe受体FcRn天然结合，不显示完整IgG抗体的天然效应子功能（例如ADCC和CDC)，并 且通常不能按照与IgG抗体相同的方式借助超抗原衍生的亲和树脂（如对Fe区特异的蛋 白A树脂）纯化。缺少Fe区的这些后果可能限制这类双特异性抗体的可实现血清半寿期、 作为活性药物成分的可行应用和制备上经济。 在属于第二类方案的第二组例子中，双特异性抗体包含IgG样分子和一个或几个 额外的附加结合结构域或实体。这类抗体包括其中单链Fv已经与重链或轻链的一个末端 融合的IgG-scFv融合蛋白（加利福尼亚州立大学，Biogen Idec，CAT/MedImmune)，和双可 变结构域（dvd-IgG)分子，其中额外VH结构域和接头与重链的N末端融合并且额外VL结 构域和接头与轻链的N末端融合（Abbott)。从总体上看，这些方案在构建体的制造、可及性 和稳定性方面存在缺点。 在属于第二类方案的第三组例子中，双特异性抗体包含IgG样抗体，所述抗体已 经以这样的方式产生或修饰，从而它们在不添加其他结合结构域或实体的情况下显示出 两种特异性。这类抗体包括IgG分子，在所述IgG分子中，例如使用工程化隆起（Ridgway 等人，Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617_21)，使用链交换法（Davis 等人，Protein Eng Des Sel.2010 Apr;23(4):195-202.Epub 2010 Feb 4)，或使用工程化反电荷法（Novo Nordisk)，已经修饰天然同型二聚的CH3域以变成异二聚体，因而潜在地使得IgG样分子的 两半部分能够通过添加至Fc区、通常N端Fab区的结合实体结合两种不同的靶。在这个第 三组例子中的抗体还包括这样的IgG分子，其中修饰不天然参与抗原接触的一些结构性环 以结合除了通过可变区CDR环天然结合的一种靶之外还有的其他靶，例如通过在Fc区内点 突变（例如，与FcgRIIb结合的Xencor Fe)或通过结构性环的多样化（例如具有多样化CH3 域的f-star Mab2)。这些方案在稳定性、制造、价态和亲和力/应用有限方面存在缺点。 与第二分类中双特异性抗体的全部以上例子相反，第一类中的双特异性抗体具有 对两种靶特异的两个互补位，所述互补位均包含位于相同异二聚VH-VL抗体可变区内部的 ⑶R残基。本领域中已经描述归属于这个第一类的仅4个类型的抗体分子。这四个类型中， 第一类型抗体不真正是双特异的，因为它不能特异性识别两种不相关的靶；第二类型抗体 天然存在，但不知道它是否可以可预测地工程化，因为没有这种研宄的例子公开；并且根据 出版物，仅第三和第四类型的抗体可以工程化，针对两种不相关的靶具有特异性。归属于这 个第一类的四类型抗体分子如下： 交叉反应抗体，其具有与两种或更多种结构上相关的抗原或表位对应的单一宽泛 特异性。对于这类抗体，两种抗原在序列和结构上相关。例如，抗体可以与来自不同物种的 相关靶如鸡卵清溶菌酶和火鸡溶菌酶（W0 92/01047)或与处于不同状态或样式的相同靶 如半抗原和与载体缀合的半抗原（Griffiths AD等人，EMBO J 1994 13:14 3245-60)交叉 反应。可以就交叉反应性而人为地工程化抗体。例如，已经将抗体工程化以识别来自不同 物种的两种相关抗原（例如Genentech :结合人LFAl的抗体经工程化还结合恒河猴LFA1， 产生成功的药物Raptiva/依法珠单抗）。类似地，WO 02/02773描述了具有"双特异性"的 抗体分子。提到的抗体分子是针对多种结构相关的抗原产生或选择的抗体，具有可以容纳 两种或更多种结构上相关的靶的单一结合特异性。然而，如上文提到，全部这些交叉反应抗 体不真正是双特异的并且未工程化以特异性识别两种不相关的靶。 另外，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于产生双特异性抗体或其功能性双特异片段的方法，包括步骤：(A)鉴定对第一目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段，包括步骤：将(i)根据权利要求10至19中任一项所述的抗体或其功能片段的集合，或(ii)抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，其中所述抗体可变结构域序列包含VL结构域和VH结构域的组合，a.其中所述VL结构域是基于选自SEQ‑ID NOs:1、3、5和7的构架，其中所述VL结构域根据SEQ‑ID NOs:8、12、18、19、27或28任一项中、尤其SEQ‑ID NOs:8、12、18或19任一项中或SEQ‑ID NOs 27或28任一项中所示的多样化方案多样化，并且b.其中所述VH结构域是基于选自SEQ‑ID NOs:2、4和6的构架，其中所述VH结构域根据SEQ‑ID NOs:9、13、20或21任一项中所示的多样化方案多样化；特别地，选自以下任一个集合的抗体或其功能片段的集合：Lib3‑L、Lib4‑L、Lib4‑LE和Lib5‑L，与所述第一目的靶接触并且筛选或选择对所述第一目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段；和(B)鉴定对第一目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段，包括步骤：将(i)根据权利要求2至9中任一项所述的抗体或其功能片段的集合，或(ii)抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，其中所述抗体可变结构域序列包含VL结构域和VH结构域的组合，a.其中所述VL结构域是基于选自SEQ‑ID NOs:1、3、5和7的构架，其中所述VL结构域根据SEQ‑ID NOs:10、14、16、22、23或29任一项中、尤其SEQ‑ID NOs:10、14、16、22或23任一项中或SEQ‑ID NO:29中所示的多样化方案多样化，并且b.其中所述VH结构域是基于选自SEQ‑ID NOs:2、4和6的构架，其中所述VH结构域根据SEQ‑ID NOs：11、15、17、24、25或26任一项中所示的多样化方案多样化；特别地，选自以下任一个集合的抗体或其功能片段的集合：Lib3‑H、Lib4‑H、Lib4‑HE_ini和Lib4‑HE，与所述第二目的靶接触并且筛选或选择对所述第二目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段；并且(C)将对步骤(A)中鉴定的抗体之一的所述第一靶上的表位特异的互补位与对步骤(B)中鉴定的抗体之一的所述第二靶上的表位特异的互补位组合，然而条件是排除来自根据权利要求20c所述的集合的抗体或其功能片段中的互补位与来自根据权利要求22c所述的集合的抗体或其功能片段中的互补位的组合。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·贝克曼，K·詹森，
申请(专利权)人：迪塔莱斯有限公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT
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