小纤溶酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种小纤溶酶突变体及其制备方法和应用。所述小纤溶酶（mPlm）突变体，是由野生型mPlmK698位点的赖氨酸突变为谷氨酰胺或天冬酰胺所得。本发明专利技术的mPlm突变体在保留了小纤溶酶原有催化活性的同时，极大降低了小纤溶酶活化过程中在K698位点的非特异性剪切带来的功能缺失，为小纤溶酶应用到溶栓药物中提供坚实的基础。传统的小纤溶酶体制备方法得率抵（仅有约3mg/L的水平）。本发明专利技术所述的表达折叠方法可获得活性小纤溶酶突变体高达600mg/L，可满足潜在溶栓药物应用中剂量需求大的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种小纤溶酶突变体，及其折叠、活化方法，以及该小纤溶酶突变体在制备溶栓药物中的应用。
技术介绍
当血块阻碍动脉血液流至身体远处部分，例如腿部、手臂、脚部或手部时，外周动脉闭塞性疾病(Peripheral Arterial Occlus1n, PA0)就会发生。PAO—个经典的早期特征就是“间歇性跋行(Intermittent claudicat1n)”或者腿部持续疼痛,但休息后疼痛消失。血液流动持续受抑最终会导致腿部或肢体甚至在休息时也仍然不断疼痛、溃疡、组织坏死、坏疽(gangrene)、并且最终导致截肢。PAO是外周动脉疾病(peripheral arterialdisease, PAD)的结果。纤溶酶原激活剂(plasminogen activator, PA),例如组织型纤溶酶原激活剂(tPA)溶栓疗法不仅可用于治疗急性心肌梗死，还可用于治疗外周动脉闭塞性疾病(Peripheral Arterial Occlus1n, ΡΑ0)ο据了角军，卢页内出血(intracerebral hemorrhage,ICH)的致命风险是比较高(0.4-2.9%)，对于PAO患者来说尤为如此，因为它的治疗时间需耗费一至两天。此外，凝缩的血块太大以及血液流通不畅均会导致可溶解血块的纤溶酶(plasmin，Plm)耗竭，而PA底物由于位于PAO血栓附近，只能发挥部分功效。鉴于此，PA溶栓疗法并未正式获得FDA的认可和批准；但由于目前美国还没有更好的药物，所以近25%的PAO病例的治疗过程都需要PA的参与。最近发表的动物研究指出，导管介入(catheter-administered)纤溶酶或它的des_kringle衍生物可能是PA的更为理想的替代物，因为它在血液中的循环半衰期非常短，不会造成溢血。除此之外，这些PA替代物不会出现由于凝缩的血块太大而造成纤溶酶耗竭的问题。我们已经制备了重组型小纤溶酶(miniPlasmin, mPlm),并证实它适用于治疗动物模型的ΡΑ0。但值得注意的是,我们之前的研究曾发现，对活性mPlm的K698位点进行非特异性剪切极大减弱了剪切产生的mPlm的比活性，从而阻碍这种有潜力的药物的进一步开发。因此，开发一类保留原有催化特性，但是非特异性剪切程度低的mPlm突变体具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一个一种小纤溶酶突变体，其保留了小纤溶酶(mPlm)原有的催化特性，但在活化过程中的非特异剪切程度低，比活力高。本专利技术的另一个目的是提供一种上述小纤溶酶突变体的制备方法。本专利技术的另一个目的是提供上述小纤溶酶突变体在制备溶栓药物中的应用。本专利技术所采取的技术方案是: 小纤溶酶(mPlm)突变体，是由野生型mPlm K698位点的赖氨酸突变为谷氨酰胺或天冬酰胺所得。所述野生型mPlm的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示。上述小纤溶酶(mPlm)突变体的编码基因。其核苷酸序列如SEQ ID N0.4或SEQID N0.5 所示。小纤溶酶突变体的生产方法，包括如下步骤: 1)将mPlm突变体编码基因插入表达载体中； 2)再将表达载体转入宿主菌中，培养携带表达质粒的宿主菌，在内含体中诱导蛋白的表达合成； 3)通过冻融和漂洗来纯化内含体纯化内含体； 4)用内含体溶解缓冲液将内含子溶解； 5)将变性蛋白再折叠成它的天然构象； 6)分离纯化正确折叠的mPlm突变体蛋白； 7)蛋白活化。步骤I)的具体操作为: (1)合成mPlm突变体基因； (2)用Nde1、BamHI双酶切mPlm突变体基因制备mPlm突变体插入片段； (3)用T4DNA连接酶将mPlm突变体插入片段接入pETll载体中，得到mPlm突变体表达载体。步骤2)的具体操作为:将mPlm突变体表达载体转化到宿主菌BL21(DE3)中，在高密度的自诱导系统中表达小纤溶酶突变体。步骤3)的具体操作为:冻融裂解收集的mPlm突变体表达菌体，超声打碎菌体裂解释放的染色质；离心收集内含体；用洗涤缓冲液漂洗内含体。步骤4)所述的内含体溶解缓冲液的组成为:8 M尿素(urea), 0.1 M Tris, I mM甘氨酸(glycine), I mM EDTA, 10 mM β -疏基乙醇(β-mercaptoethanol), 10 mM二硫苏糖醇(DTT)，I mM谷胱甘肽(GSH)，0.1 mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，pH 10。步骤5)是采用PI开发的Pt-Fold “通用”再折叠程序将变性蛋白再折叠成它的天然构象。步骤6)所述的亲和层析方法为SEC、IEX或采用苯甲醚-琼脂糖凝胶6B柱(Benzamidine Sepharose 6B column)进行的亲和层析法。步骤7)的具体操作为:再折叠纯化后的mPlm突变体经SAK活化成有活性的mPlm。小纤溶酶突变体在制备溶栓药物中的应用。本专利技术的有益效果是: 本专利技术的mPlm突变体在保留了小纤溶酶原有催化活性的同时，极大降低了小纤溶酶活化过程中在K698位点的非特异性剪切带来的功能缺失，为小纤溶酶应用到溶栓药物中提供坚实的基础。传统的小纤溶酶体制备方法得率抵(仅有约3mg/L的水平)。本专利技术所述的表达折叠方法可获得活性小纤溶酶突变体高达600mg/L，可满足潜在溶栓药物应用中剂量需求大的要求。【附图说明】图1为野生型和突变型mPlm的活化位点，其中A为野生型和突变型mPlm被SAK活化后进行SDS-PAGE电泳分析，分子量标准大小标示在电泳图右侧。顶层字母表示mPlm野生型及个突变体(*代表野生型，单字母标示K698突变成的氨基酸)。野生型mPlm在K698位非特异剪切后产生的两条主要条带(15.0 and 10.2 KD)由粗体标出。而在mPlm突变体种不存在这两个非特异剪切条带。在野生型和突变型mPlm中都有R561位特异活化剪切后产生的两条主要条带(25.2 and 13.3 KD)，在图中由红色圆点标出。另外图的左侧也标出了非特异剪切所产生的次要条带。B为活化实验中使用的的SAK (16 KD)。C为野生型和突变型mPlm在R561特异剪切示意图。上图还标明了野生型mPlm在K698位非特异剪切产生的主要和次要条带示意图。下图还标明了 mPlm突变体因K698位的突变而不会产生两条非特异剪切条带(15.0 and 10.2 KD)。图2为小纤溶酶(mPlm)突变体突变位点示意图，其中，A为野生型mPlm，B为mPlm突变体K698Q, C为mPlm突变体K698N。图3为野生型mPlm和16个mPlm突变体(包括K698Q和K698N)的纯化电泳图。用Superdex-200 SEC column分离纯化正确折叠的mPlm突变体。分离纯化组分通过非还原SDS-PAGE胶(4-12%)检测。SEC图中红色箭头所指组分是正确折叠的有催化活性mPlm突变体。图4为mPlm突变体对动脉血块的作用效果图。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。一、实验材料与试剂 1、菌株与质粒:GC1-5 a Ch本文档来自技高网...

【技术保护点】
小纤溶酶（mPlm）突变体，是由野生型mPlm K698位点的赖氨酸突变为谷氨酰胺或天冬酰胺所得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蔺新力，李华平，林小涛，鲁隼，黎志威，
申请(专利权)人：广州复能基因有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44