本发明专利技术涉及一种经修饰的蛋白，其包含具有卷曲螺旋结构域的蛋白和具有如SEQ ID NO:1所示序列：ZXBBBBZ的肽，所述肽连接到卷曲螺旋结构域，其中：·Z是任意氨基酸或是缺失的；·X是任意氨基酸；·B是精氨酸(R)或赖氨酸(K)。所述经修饰的蛋白具体而言是一种抗原或与抗原相连的载体蛋白。这种经修饰的蛋白对带负电荷的聚合体(如核酸或肝素)具有增加的亲和性，并显示出增加的免疫原性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】具有改进特性的经修饰的卷曲螺旋型蛋白 本专利技术涉及含有卷曲螺旋（coiled coil)结构域的重组抗原或与含有卷曲螺旋的 蛋白融合的抗原，其中所述卷曲螺旋是经修饰的。该修饰改进了所述抗原的免疫原性。同 时，其改进了它们结合带负电荷的聚合物（如核酸，包括DNA和RNA)以及结合肝素的能力。
技术介绍
卷曲螺旋是蛋白质中的一种结构基序，其中α-螺旋如绳线般卷曲在一起。卷曲 螺旋结构域在天然蛋白中含量丰富（1，2)，并且可能是自然界中对蛋白进行寡聚化的最普 遍的方式。卷曲螺旋由相互缠绕成超螺旋的两个或更多α-螺旋组成，所述超螺旋是一种 简单但多用的蛋白折叠（3)。典型的卷曲螺旋一级序列是重复的，由称为"七肽（heptad)" 的七残基重复序列构成。 许多卷曲螺旋型蛋白与重要的生物学功能有关。此处重点关注的是那些抗原中或 载体蛋白中发现的卷曲螺旋。 抗原中发现的卷曲螺旋的例子包括但不限于： i)在OCA家族（其中OCA意指低聚的卷曲螺旋附着）中发现的二聚的卷曲螺 旋：例子有NadA，一种脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis)保护性抗原（4);来 自小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica)的YadA(5);来自粘膜炎莫拉氏菌 (Moraxella catarrhalis)的 UspA2(6);来自汉氏巴尔通氏体（Bartonella henselae)的 BadA(7)和来自流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza)的 HadA(8)。 ii)在流感血凝素 HA2蛋白中（除其他以外）发现的三聚的卷曲螺旋（9)、呼吸 道合胞体病毒的F糖蛋白（10)、HIV-I (11)和HIV-2 (12)的gp41糖蛋白、和埃博拉病毒的 gpl，2(13)。 iii)在新城病NH(血凝素-神经氨酸酶）糖蛋白和其他副黏液病毒（14,以及其 中的参考文献）中发现的四聚的卷曲螺旋。载体蛋白具体用于改进抗原的免疫原性。含有 卷曲螺旋的载体蛋白此前已有描述，尤其是来源于C0MP(15)的五聚体和同样形成五聚体 的人工序列（34)，以及来源于哺乳动物C4bp寡聚化结构域（如鼠类结构域IMX108 (16)， 或鸟类C4bp寡聚化结构域（16, WO 2005/077976和WO 2007/062819))的五聚体。称为 MX313 (W0 2007/062819)的杂聚的（hybrid)鸟类寡聚化结构域在此处用作实例。 现有技术 在现有技术中，卷曲螺旋一直是大量研宄的主题以理解什么决定它们的寡聚化状 态以及它们的螺旋的相关取向（orientation)(平行的或反平行的）（35)。但是，一直缺乏 通过修饰抗原的卷曲螺旋从而改进其免疫原性的研宄。现有技术关注组群中有两个值得注 意的例子涉及到了疫苗产业中，出于免疫接种的考虑，其需要纯化两种包含卷曲螺旋的分 开的抗原（10, 36, 37);但两组均未修饰抗原中的卷曲螺旋。 在现有技术中已经显示，一些特定的肽改进缺乏卷曲螺旋的单体蛋白的结合特 性。已经显示，当多聚精氨酸尾部与重组蛋白融合时，其更易于通过离子交换层析法进行纯 化（17, 18)。在此前的使用中，在通过酶方法纯化后将额外的精氨酸移除（17, 18)，或者将 其留在原处并用于酶固定化和/或重折叠（19, 20)。将短如六个连续精氨酸的肽用于将单 体酶固定化于肝素 -S印harose柱上，防止单体通过基质结合而聚集并允许的酶的再次使 用（19,20)。Fuchs和Raines已经显示了 9个氨基酸的多聚精氨酸标签能用于将单体酶 (RNase A)固定在多种支持物上，如玻璃和硅土树脂（22)。 已经公开了其他的核酸结合肽，如基序SPKK(其在1980年代鉴定为DNA结合基 序）以及含有基序SPKK的肽，能够结合双链DNA (21)。然而，未证明对RNA或单链DNA的结 合，并且Suzuki的数据强有力地表明对单链DNA的结合是不会发生的，因为只有双螺旋分 子中存在小沟。 其他已显示结合DNA的肽包括乙型肝炎核心抗原的鱼精蛋白样结构域（38)，其含 有肽序列SPRRRRS，用于本申请的一些例子中。 然而，一些多聚精氨酸尾部非常易被蛋白酶切割，尤其是丝氨酸蛋白酶，并且它们 在常规用途中已经被多聚组氨酸标签所替代，二者均用于纯化和固定化目的（45)。 另外在现有技术中，已经将肽与单体蛋白融合以改进它们的免疫原性。Shibagaki 及同事已显示蛋白转导结构域（protein transduction domains, PTDs)能用于改进体外树 突细胞（DCs)的转导，并显示当转导的DCs再次注入动物时，得到了抗原的改进的免疫原性 (43)。此外，Shimada及同事已经显示无论是直接注入表达所述蛋白的肿瘤时还是皮内注 射时（41)，多聚精氨酸肽都能改进其融合的蛋白，卵清蛋白的免疫原性（42)。 最为纯化的抗原是弱免疫原性的。已使用佐剂来增加它们的免疫原性。先前已经 证明使用C4bp蛋白的含有卷曲螺旋的小结构域以增加抗原的免疫原性： ?WO 2007/062819描述了一种复合物，其包含作为第一组分的鸟类C4bp结构域和 作为第二组分的抗原，所述组分以融合蛋白的形式存在或非共价地结合。这种复合物在施 用于生物体时显示了抗原的增加的免疫原性。 ^WO 2011/045612描述了含有来自鸡的C4bp蛋白的片段的融合蛋白，以及分枝杆 菌抗原85A。所述杂合蛋白不仅在如啮齿类的动物中且在灵长类中都改进了 85A免疫原性。 此外，为了改进固定化的方法，通过TLR受体诱导信号传输也是非常重要的，但其 至少与能限制这种信号传输同样重要。Toll样受体（TLRs)是一类在天然免疫系统中起重 要作用的蛋白。一旦微生物破坏了生物体的物理屏障，它们就被TLRs所识别。微生物被识 别的特征包括病毒的双链RNA、细菌的未甲基化的CpG位点、和某些其他RNA和DNA分子。 在这种核酸中存在实质利害关系，因为它们是一类Toll样受体（下文称为TLRs) 的配体，尤其是TLR3、TLR7、TLR8、TLR9和TLR13的配体（23及其中的参考文献）。这些有 时被归类为"细胞内Toll样受体"，但至少TLR3也在一些细胞表面存在（24)。TLR7和TLR9 定位在细胞内区室（尤其是内质网和内体（endosome))中，并且已经清楚地显示对于TLR9 和TLR7而言，受体的切割对于MyD88的激活是必需的，通过所述激活受体的配体进行信号 传输（25,26)。因为这种切割仅在内吞溶酶体（endolysosomes)中发生，其可能是一种进化 适应，以避免来自自身核酸的不适当的信号传输。 TLR3通过多种上皮细胞表达，包括气道、子宫、角膜、阴道、子宫颈、胆和肠的上皮 细胞，并且这些细胞表现出在其细胞表面表达TLR3 (24)。因此，可能并不令人惊讶的是，对 聚I: C的施用与一些不良反应有关（26)。在那项研宄中，采用了以3毫克/克的剂量的重 复施用。如果小鼠平均重量为约35g，则重复施用IOOmg的剂量能诱导这些反应。在此处所 述的免疫接种中我们仅需2. 5 μ g的多聚I :C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种经修饰的蛋白，其包含：(i)具有卷曲螺旋结构域的蛋白和(ii)至少一个连接到所述卷曲螺旋结构域的带正电荷的肽，所述带正电荷的肽具有如SEQ ID NO:1所示序列：ZXBBBBZ，其中：·Z是任意氨基酸或是缺失的；·X是任意氨基酸；·B是精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·德尔坎波阿斯卡拉泰尔，I·特基哈尼，F·希尔，
申请(专利权)人：艾马克西欧，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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