本发明专利技术公开了一种荧光素类H2S荧光探针及其制备和应用，所述探针的制备方法为：在烧瓶中按摩尔比1：2.2加入荧光素、1-溴-2,4-二硝基苯，以无水二甲基甲酰胺为溶剂，在室温条件下搅拌反应12h，TLC跟踪至反应结束；减压蒸馏除去溶剂后得到粗产品，用硅胶柱色谱提纯，得到3',6'-双（2,4-二硝基苯氧基）-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮。本发明专利技术具有以下优点：原料便宜易得，目标产物合成步骤简单、收率高；探针激发和发射光谱在可见区，化学稳定性好。荧光探针在乙腈和HEPES的混合溶液中，对H2S具有特异的选择性并且不受其他因素的干扰。荧光探针具有较低的检测限和较短的反应时间，可以对细胞内的H2S进行实时检测，有望在医学、生物及相关领域获得广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学领域，涉及一种荧光素类H2S荧光探针及其制备和应用，该探 针是以荧光素为发色团设计的荧光素类衍生物荧光探针，通过与H2S反应生成荧光素，实现 荧光"开-关"过程，以此来检测细胞内的H2S。
技术介绍
众所周知，H2S是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体。然而，近几年的研究表明，H 2S 是继NO、CO之后又一重要的气体信号分子。它在调节心血管、神经、免疫、内分泌及肠胃系 统方面有着重要的作用。1H2S是哺乳动物系统产生的一种内源性气体，主要由两种磷酸吡 哆醛类酶，胱硫醚β-合成酶（CBS)、胱硫醚Y-裂解酶（CSE)催化L-半胱氨酸反应生成。2作为信号分子，H2S可以调节神经传递、2松弛平滑肌、3调节胰岛素的释放、 4调节炎症以及 抑制细胞凋亡等。5内源性的H2S水平被认为与许多疾病相关，如阿尔茨海默病、6唐氏综合 症、7糖尿病8和肝硬化。9在动物疾病模型中，H2S抑制剂、H 2S供体显示了 H2S的治疗开发 潜力。1(1因此，将生物体系内H2S的浓度、分布可视化显得尤为重要且有益于阐明H2S的生 物学作用。 相比于已经报道的检测方法，如比色法8、电化学分析法9及气相色谱分析法 1(1等， 小分子荧光探针具有高灵敏度、实时成像、高时空分辨率等优势。目前，已经报道的H2S荧 光探针多是利用H2S的还原性或亲核性等反应特性来设计的。1H6由于特异性反应的识别 机制，即使在存在干扰的情况下，大多数H2S荧光探针仍具有很高的选择性。然而，考虑到在 生物组织中的应用，H2S荧光探针在设计中仍然需要考虑到其他一些因素，如生物相容性、 高吸收系数、荧光量子产率、可见光激发、高稳定性和高信噪比等。 荧光素及其衍生物是生物学家和化学家广泛使用的一类有机荧光染料。由于它们 良好的生物相容性、高吸光度、高荧光量子产率、良好的光稳定性等，荧光素及其衍生物经 常被用于设计荧光探针、细胞标签及免疫探针等。例如，已报道的靶向FR-α的叶酸偶联异 硫氰酸荧光素是第一个利用肿瘤特异性荧光成像技术对疑似卵巢癌病人肿瘤组织进行实 时外科手术可视化的范例。17螺内酯型荧光素衍生物是一类无色无荧光物质，当相应的内酯 开环后，就产生了强烈的绿色荧光。18近年来，由于螺环开环机理具有高信噪比的优势，人 们采用这一机理成功的设计开发了大量的并用于检测金属离子、阴离子、小分子等的荧光 探针。19'2°但遗憾的是，只有极少数基于开环机理的荧光素衍生物被设计成H2S荧光探针并 用于活细胞成像。21_24因此，我们设计合成了一种新的基于荧光素内酯开环的荧光探针，并 将其应用在活细胞内H2S的检测成像。荧光素两个羟基用1-溴-2, 4-二硝基苯保护起来， 通过与H2S反应脱去保护、荧光素开环，实现了荧光从无到有的过程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够识别细胞内H2S的荧光素类荧光探针。 本专利技术的技术方案是，一种荧光素类检测H2S的荧光探针，结构式如下： 本专利技术所述荧光素类检测H2S的荧光探针的制备方法，包括以下步骤： 3'，6'-双（2, 4-二硝基苯氧基)-3H-螺-3-酮的合成： 在无水二甲基甲酰胺中按摩尔比1:2. 2~1:4. 4加入荧光素、1-溴-2, 4-二硝基苯，室温条 件下搅拌反应过夜，TLC跟踪至反应结束；减压蒸馏除去溶剂后得到粗产品，用硅胶柱色谱 提纯，得到3'，6' -双（2, 4-二硝基苯氧基）-3H-螺-3-酮。其 合成路线如图1所示。 本专利技术还提供了所述荧光素类检测H2S的荧光探针的应用：该探针可用于检测细 胞内的h2s。 本专利技术具有以下优点：原料便宜易得，目标产物合成步骤简单、收率高；探针激发 和发射光谱在可见区，化学稳定性好。荧光探针在乙腈和HEPES的混合溶液中，对H2S具有 特异的选择性并且不受其他因素的干扰。荧光探针具有较低的检测限和较短的反应时间， 可以对细胞内的H2S进行实时检测，有望在医学、生物及相关领域获得广泛应用。【附图说明】 图1本专利技术荧光探针的合成路线图； 图2本专利技术荧光探针1的1H NMR谱图； 图3本专利技术荧光探针1的13C NMR谱图； 图4本专利技术荧光探针1的HRMS谱图； 图5本专利技术荧光探针1与H2S反应的HPLC-MS谱图； 图6本专利技术荧光探针1的H2S滴定荧光发射光谱谱图； 图7本专利技术荧光探针1的H2S滴定紫外吸收光谱谱图； 图8本专利技术荧光探针1在加入H2S后随时间变化的荧光发射光谱谱图； 图9本专利技术荧光探针1在加入H2S后随时间变化的紫外吸收光谱谱图； 图10本专利技术荧光探针1针对不同阴离子的选择性柱状图； 图11本专利技术荧光探针1在细胞中识别H2S的荧光成像图。【具体实施方式】 下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不限于此。 实施例1 -种荧光素类检测H2S的荧光探针的合成，基本步骤如下。 3'，6'-双（2, 4-二硝基苯氧基）-3H_螺-3-酮的合 成： 在圆底烧瓶中按摩尔比I :2. 2加入荧光素、1-溴-2, 4-二硝基苯，以无水二甲基 甲酰胺为溶剂，在室温条件下搅拌反应12h，TLC跟踪至反应结束。减压蒸馏除去溶剂后 得到粗产品，用硅胶柱色谱提纯，得到3'，6' -双（2, 4-二硝基苯氧基）-3H-螺-3-酮的合成。 1H NMR (400MHz, CDCl 3) : δ 8. 86 (d, J = 2. 8Hz, 2H) , 8. 40 (dd, J = 2. 8H z, 2H) , 8. 08 (d, J = 7. 6Hz, 1H) , 7. 79-7. 69 (m, 2H) , 7. 26-7. 20 (m, 3H) , 6. 96 (s, 1H)，6. 94 (s, 1H)，6. 87-6. 84 (m, 2H) ·(如图 2 ) 13C NMR (101MHz，CDC13) δ 168. 66, 155. 77, 154. 54, 152. 24, 142. 53, 140. 30, 135. 6 5, 130. 53, 130. 46, 128. 97, 126. 18, 125. 61, 123. 83, 122. 17, 120. 06, 116. 92, 116. 06, 108. 4 6,81.03.(如图 3) HRMS(ESI)calcd for C32H17N4O13665. 0792, found665. 0794.(如图 4) HPLC-MS跟踪荧光探针I与H2S的反应过程，结果显示：1与H2S的反应先脱去一侧 羟基保护基。随着反应时间延长，脱去另一侧保护基。荧光探针1继续与H2S反应实现荧 光开启响应，但醌式与酮式相互转换，同时存在。（如图5) 实施例2 :突光探针1的H2S滴定实验的溶液配制 5ml PE管中，加入20 μ 1浓度为2mM的荧光探针1溶液，4ml CH3CN与HEPES的混 合溶液。这样得到的待测溶液中含有IOX KT6Hi0I · Γ1的荧光探针1。 实施例3 :突光探针1的H2S滴定荧光光谱性质的测定 图6为荧光探针1的H2S滴定荧光发射光谱。荧光探针的浓度为IOX 10_6mol ·ΙΛ 激发波长分别为450nm。从图6可以看出，荧光探针1随着H2S浓度的增加，荧光强本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光素类检测H2S的荧光探针，其特征在于，结构式如下： 。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，刘慧盈，赵秒，乔庆龙，郎海静，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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