本发明专利技术公开了一种高效建立转基因小鼠模型的辅助质粒及其构建方法。该辅助质粒与外源基因共转染小鼠受体细胞时,辅助质粒能在小鼠基因组特异性靶位点序列上形成32个缺口,为外源基因提供32个整合热点,能显著提高外源基因整合进入小鼠基因组的效率。该辅助质粒的构建过程简单、廉价,普通的实验室也可自行完成构建,其可直接与不同的外源基因共转染小鼠受体细胞,操作方法简单。本发明专利技术公开的辅助质粒能有效的提高制备小鼠稳定表达转基因细胞株的效率,能实现各种人类疾病转基因小鼠模型的高效构建,有利于人类疾病发病机理的研究和基因治疗的发展。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
,具体涉及一种高效建立转基因小鼠模型的辅助质 粒及其构建方法。
技术介绍
人类疾病的发展十分复杂,以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制,推 动医药学的发展来之缓慢,临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性,而且许多 实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研宄,可以有意识地改变那 些在自然条件下不可能或不易排除的因素,以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾 病进行比较研宄,有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生发展规律,研宄防治措施。 小鼠是生物医学领域中用途最广泛、使用量最大的哺乳类实验动物,是人类疾病 理想的动物模型,不仅因为小鼠在生理上与人类极为相似,而且小鼠的遗传资源非常丰富, 其大量的遗传变异可作为研宄人类疾病的借鉴。小鼠动物模型可通过化学性诱导、免疫学、 遗传性等方法获得,但自发或诱发病理动物模型需要漫长的时间,用转基因鼠模型研宄人 类疾病的优点在于小鼠与人类在生理学方面比较类似,小鼠突变表型接近人类遗传病的表 型,小鼠基因与人类基因相似度可达99%;小鼠基因组序列和连锁图已比较清晰;小鼠的遗 传背景比较稳定;并且小鼠繁殖速度快,每窝产仔多,便于做对照。 目前,建立转基因小鼠模型的常用方法有以下几种:显微注射法、逆转录病毒感染 法、胚胎干细胞介导法、定点整合法(即基因打靶)等。1)显微注射法:是最常用的转基因 方法,优点是任何DNA都可以直接导入受精卵原核内,整合进入宿主基因组的效率较高,实 验周期较短。其主要缺点是不能控制转基因的整合位点及整合的拷贝数。另外,建立单纯 转基因小鼠的设备相对也比较昂贵,操作者要求有较高的技术操作水平。2)逆转录病毒感 染法:它的外源基因通常是单位点、单一拷贝整合,整合通常发生在逆转录病毒的长末端重 复区,从而保证了外源基因结构的完整性。但是整合效率较低,而且操作比较繁琐,能被导 入的基因大小有一定限制。3)胚胎干细胞介导法:用重组的逆转录病毒作为载体感染体外 建株的胚胎干细胞(EK细胞),再将此EK细胞移植入受体囊胚腔,可发育成携带着特定外源 DNA的个体。该方法的优点是外源DNA的整合率高,整合在生殖细胞中的比例也很高。缺点 是EK细胞株不易建立,长期培养后出现细胞分化现象,生产的转基因动物都是嵌合体。4) 基因打靶:是利用DNA同源重组的原理,在体外培养的小鼠的干细胞用突变的靶基因同源 序列来取代正常基因。它克服了随机整合的盲目性和偶然性,是目前能精确修饰、改造生物 基因组最理想、最有效的一种方法。基于基因打靶途径建立的人类疾病转基因小鼠模型在 人类疾病的发病机理和基因治疗中发挥着不可估量的巨大作用,但是高等真核生物细胞内 外源DNA与靶细胞DNA序列发生同源重组的几率非常低,这是束缚基因打靶技术发展的主 要因素。
技术实现思路
本专利技术的目的首先在于解决用基因打靶技术在构建人类疾病转基因小鼠模型过 程中外源基因整合进入受体基因组效率低的问题,提供了一种高效建立转基因小鼠模型的 辅助质粒。本专利技术的另一目的在于提供上述辅助质粒的制备方法。 为了达到本专利技术的目的,本专利技术人在纯系C57BL/6-GFP小鼠胚胎成纤维细胞上 针对 GFP 基因使用 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene plasmid ID :42230,以 下简称 pSpCas9 (BB))载体构建 pSpCas9 (GFP)质粒(参见 Maggio I,Holkers M,Liu J, Janssen JM,Chen X, Gonsalves MA. Adenoviral vector delivery of RNA-guided CRISPR/ Cas9nuclease complexes induces targeted mutagenesis in a diverse array of human cells. Sci R印· 2014,4 :5105),共转染线性化质粒pDsRed2-Nl,结果发现4组转染后细 胞(空白组、pSpCas9(GFP)、pDsRed2-Nl、pDsRed2-Nl+pSpCas9(GFP))在继续培养传代 5 次后,带有绿色荧光细胞的比例分别为0. 07 %、0. 09 %、0. 412 %、6. 67%,测序分析共转染PDsRed2-Nl+pSpCas9 (GFP)组发现,线性化质粒pDsRed2-Nl成功整合进GFP基因特异性靶 位点序列的位置,说明pSpCas9 (GFP)质粒在GFP基因上为线性化质粒pDsRed2-Nl提供的 整合热点,提高了 pDsRed2-Nl质粒整合进入GFP基因的效率。 在以上探索研宄的基础上,本专利技术人发现在小鼠基因组中有一特异性靶位点序 列,该靶位点序列在小鼠基因组中有32个拷贝。通过该特异性靶位点设计并构建的辅助质 粒能为外源基因提供32个整合热点,提高了外源基因整合进入小鼠基因组的效率。同时, 辅助质粒可直接与不同的外源基因共转染受体细胞,能有效实现各种人类疾病转基因鼠模 型的构建。在以上探索研宄的基础上,本专利技术人提出了 一种高效建立转基因小鼠模型的辅 助质粒及其制备方法。 本专利技术公开的一种高效建立转基因小鼠模型的辅助质粒,其特征在于:该辅助质 粒与外源基因共转染小鼠受体细胞时,辅助质粒能在小鼠基因组特异性靶位点序列上人工 形成32个缺口,为外源基因提供32个整合热点。 上述的一种高效建立转基因小鼠模型的辅助质粒,其特征在于该辅助质粒是按照 以下步骤构建的: (1)将pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒酶切,酶切后产物经琼脂糖电泳 回收含有 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 的片段; (2)设计针对小鼠基因组特异性靶点序列的寡核苷酸; (3)将步骤⑵设计的寡核苷酸连入步骤(1)回收的pX330-U6-Chimeric_ BB-CBh_hSpCas9片段中,将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞,挑取生长良好的单 克隆,37°C振荡培养过夜,提取质粒。 上述的,其特征在于所述 的外源基因为 pDsRed-Nl、pEGFP-Nl、pbabe-c_mycT58A+HRasG12V 中的任意一种。 上述的,其特征在于所述 的小鼠基因组上特异性靶位点序列如SEQ ID NO. 1所示,对应的寡核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 所示。 本专利技术的有益效果在于:本专利技术公开的辅助质粒能在小鼠基因组特异性靶位点序 列上人工形成32个缺口,为外源基因提供了 32个整合热点,从而能显著提高外源基因整合 进入小鼠基因组的效率;该辅助质粒的构建过程简单、廉价,普通的实验室也可以自行完成 构建,其可直接与不同的外源基因共转染小鼠受体细胞,操作方法简单;本专利技术公开的辅助 质粒能有效的提高制备小鼠稳定表达转基因细胞株的效率,能实现各种人类疾病转基因小 鼠模型的高效构建,有利于人类疾病发病机理的研宄和基因治疗的发展。【附图说明】 为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本专利技术提供如下附图: 图1为流式细胞仪分析瞬时转染本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效建立转基因小鼠模型的辅助质粒,其特征在于:该辅助质粒与外源基因共转染小鼠受体细胞时,辅助质粒能在小鼠基因组特异性靶位点序列上人工形成32个缺口,为外源基因提供32个整合热点。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:周勇,温平,申友锋,唐秋月,何燕,刘兰兰,向垚艮,李建均,
申请(专利权)人:重庆高圣生物医药有限责任公司,
类型:发明
国别省市:重庆;85
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。