本发明专利技术公开了一种用于快速检测细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因PME的LAMP试剂盒及检测方法。所述试剂盒中包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，分别如SEQ ID NO.1-6提取待检细菌基因组DNA，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60-65℃对DNA样品进行扩增，加入显色剂观察反应管内的颜色变化来判断扩增与否。本发明专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、检测简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病原微生物的检测，具体涉及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速检测细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因PMEmm
技术介绍
超广谱β -内酰胺酶(ESBL)属Bush分类中的2型酶，是一类能水解青霉素酶类、头孢菌素类以及单环类抗生素的内酰胺酶，能产生ESBL的细菌即为ESBL(+)菌，可对上述多种抗生素产生耐药。根据编码ESBLs基因同源性，可将其分为TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型等共5个类别，每个类别含有多种亚型，且每种类别及其亚型水解药物的特性会有所差别。而我们前期发现并报道了一种全新类别的ESBLs—PME (Pseudomonasaeruginosa ESBL I)。PME对头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟和氨曲南等临床常用的β-内酰胺类药物都耐药(MIC，^ 64 mg/ml)。通过分析临床资料发现产PME耐药菌株具有强致病、高耐药等特点。因此，寻找一个合适的基因的检测方法可以为临床治疗提供很好的基础。传统的传统的微生物培养法和药敏试验法能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。因而研发一种简便、快速的细菌超广谱内酰胺酶耐药基因的检测方法具有极大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于快速检测细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因PME的LAMP试剂盒、以及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速检测细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因/??的方法。本专利技术所采取的技术方案是: 一种用于快速检测细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因产量的LAMP引物组，其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，核苷酸序列分别如下所示:内引物 1:5’ - CGGTCTTCGGGTACGAGCGGAGCCAGACATGAATCTG -3，(SEQ ID N0.1)；内引物 2:5’ - GCGAATGGATGGTTGAAACCGGGTCTTGTTCGGCATCAG -3’ (SEQ ID N0.2)；外引物 1:5’ - CAGTGGCGATGAAGTGAG -3’ (SEQ ID N0.3)；外引物 2:5’ -CCAGAACACCGCGACATC -3’ (SEQ ID N0.4)；环引物 1:5’ - CTCGGAGGTGAACAGACG -3’ (SEQ ID N0.5)；环引物 2:5’ - AGACCGGTTCTGCAATCG -3’ (SEQ ID N0.6)。一种用于快速检测细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因/W庙勺LAMP试剂盒，其包括上述用于快速检测细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因产量的LAMP引物组。作为优选的，所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6-8:1:3_4。作为优选的，所述试剂盒中还含有:DNA聚合酶，LAMP反应液，显色剂，阳性对照和阴性对照。作为优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。作为优选的，所述LAMP反应液含有:10 mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSCVK溶液、5 mM甜菜碱，四者的体积比为6-8:4-5:2-3:8_10。作为优选的，所述显色剂为SYBR GREEN I。作为优选的，所述阳性对照为含有细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因片段的质粒，所述细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因/??片段如SEQ ID N0.7所示；所述阴性对照为DEPC水。一种快速检测细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因产量的方法，包括如下步骤: (1)提取待检样品DNA； (2)利用上述用于快速检测细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因产量的LAMP引物组对待检样品DNA进行等温扩增； (3)结果判断:在上述反应管中加入1_2μ?显色剂10XSYBRGREEN I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为产量超广谱内酰胺酶耐药基因，橙色则为非产量基因。作为优选的，等温基因扩增反应的25 μ L反应体系含有:内引物各8pmol/>L，外引物各I pmol/^L，环引物各4 pmol/^L，反应液12.5μ?，DNA聚合酶8U，待检DNA 1-100 ng，用灭菌去离子水补齐到25μ? ;等温基因扩增反应的条件为:60-65°C反应55_65min。本专利技术的有益效果是:专利技术针对细菌超广谱内酰胺酶耐药基因/W府寺异性设计了 6条引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性，能准确地将细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因与其他非细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因区分开来。另夕卜，本专利技术的试剂盒方便快捷，能在较短的时间内鉴别细菌超广谱内酰胺酶耐药基因ZWi?，不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高；特异性好，适合现场检测。【附图说明】图1为本专利技术对细菌超广谱内酰胺酶耐药基因产量以及对非细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因的扩增结果(一:阴性样品，+:细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因/??样本)； 图 2 为实施例 3 的特异性验证结果(l:DEPC，2:C7Z-#-l，3:/^E；4: SMB, 5: CMY-2,6: TEM, 7:1MP, 8: VIM and CMY-2)； 图3为实施例4的LAMP灵敏度实验结果(a::本专利技术LAMP扩增的电泳结果；b:本专利技术LAMP扩增的显色结果；其中，I为DEPC，2?8为含有细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因/WA的 pBSCK 质粒，浓度依次为 1.0XlO-1U.0XlO-0U.0XlO1U.0XlO2U.0XlO3U.0XlO4,1.0Χ105、1.0X 16 拷贝 /yL)o图4为实施例4的常规PCR灵敏度实验结果(其中，I为DEPC，2?9为含有细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因的PBSCK质粒，浓度依次为1.0 X 10 _°、1.0 X 101、1.0 X 102、1.0X103、1.0X104、1.0X105、1.0X106、1.0XlO7 拷贝 /yL)o【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1用于快速检测细菌超广谱内酰胺酶耐药基因的LAMP试剂盒的建立 用于快速检测细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因的LAMP试剂盒，包括以下成分:(I)特异性引物组；(2) DNA聚合酶；(3) LAMP反应液；(4)显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。( I)特异性引物的设计: 根据细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因PME (GenBank登录号为:HQ541434)的特异性设计6条特异性引物，序列分别如下:内引物 1:5’ - CGGTCTTCGGGTACGAGCGGAGCCAGACATGAATCTG -3’ (SEQ ID N0.1)；内引物 2:5’ - GCGAATGGATGGTTGAAACCGGGTCTTGTTCGGCATCAG -3’ (SEQ ID N0.2)；外引物 1:5’ - CAGTG当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于快速检测细菌超广谱β‑内酰胺酶耐药基因PME的LAMP引物组，其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，核苷酸序列分别如下所示：内引物1：5’‑ CGGTCTTCGGGTACGAGCGGAGCCAGACATGAATCTG ‑3’（SEQ ID No.1）；内引物2：5’‑ GCGAATGGATGGTTGAAACCGGGTCTTGTTCGGCATCAG ‑3’（SEQ ID No.2）；外引物1：5’‑ CAGTGGCGATGAAGTGAG ‑3’（SEQ ID No.3）；外引物2：5’‑CCAGAACACCGCGACATC ‑3’（SEQ ID No.4）；环引物1：5’‑ CTCGGAGGTGAACAGACG ‑3’（SEQ ID No.5）；环引物2：5’‑ AGACCGGTTCTGCAATCG ‑3’（SEQ ID No.6）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田国宝，黄曦，钟兰兰，张雪飞，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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