用于病毒增殖的两阶段温度分布制造技术

本发明专利技术提供了一种用于生产病毒的方法，该方法包括提供已经被病毒感染的寄主细胞并且在两种不同温度下培养被感染的寄主细胞。随后收集培养步骤中所产生的病毒。通过使用两阶段温度培养工艺，可以得到高滴度和改进的纯度。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是基于以下中国专利申请的分案申请： 原案申请日：2008年4月30日 原案【申请号】200880021212. 0(PCT/EP2008/003532) 原案申请名称：用于病毒增殖的两阶段温度分布 本申请要求申请日为2007年5月4日的美国临时专利申请No. 60/927,693的优 先权，现将其全部内容并入本文作为参考。
本专利技术涉及病毒增殖领域。
技术介绍
在动物细胞培养基中的病毒增殖是在取决于病毒和用于增殖的宿主体系的特性 的温度条件下进行的。选择特定的温度用于细胞的生长（在细胞培养基或者胚卵的繁殖 中），接着选定温度用于病毒的增殖。在大多数情况下，病毒增殖温度低于细胞增殖温度。 对温度敏感的病毒增殖涉及到在大约围绕用于昆虫细胞培养（随着例如杆状病毒产生）的 20°C的温度范围内、以及在用于哺乳动物细胞培养中的病毒制备的直至约37°C的温度下影 响病毒增殖速度和抗原形成，使用对于每种病毒/寄主细胞组合的特定的最适条件。更高 的温度会影响感染动力学和病毒的稳定性。当病毒在37°C温度下增殖时，在后续的病毒复 制期间会经常观察到降低的病毒滴度和更低的病毒抗原质量。这种影响对于用于疫苗生产 的大规模病毒增殖可能具有不利的后果。 本专利技术的目标在于提供改善的生长条件，其不会影响生产的用于疫苗目的的抗原 质量。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于病毒生产的方法，其中，一种以上寄主细胞被病毒感染，然 后在第一温度下培养（例如，在31°C至37°C的温度下培养1至48小时）；并且随后在第二 温度下培养，该第二温度比第一温度低（例如，低1至6°C)。然后收集这些培养步骤中所 产生的病毒。 现在令人惊讶地发现，对于许多病毒包括流感（正粘病毒）、罗斯河病毒 (Alphaviridae)和西尼罗河病毒（黄病毒），培养条件可以通过使用两阶段温度分布而被 实质性地改进。更高的温度被应用于病毒增殖的第一阶段，其可促进传染性病毒颗粒的形 成。在第二阶段，采用较低的温度，以便维持在更高温度的增殖期间中获得的初始高滴度， 并且允许稳定的抗原的形成，该抗原可以被进一步用于免疫原性疫苗的生产。【附图说明】 图1A-1B:在Vero细胞中于（A)32°C和⑶36°C下增殖的新喀里多尼亚（New Caledonia)病毒的抗原显带图形。 图2A-2D:在感染以后在37°C下不同时间点罗斯河病毒（RossRiverVirus，RRV) 感染的NaBr曲线图。 图3A-3D:在感染以后在35°C下不同时间点罗斯河病毒感染的NaBr曲线图。 图4A-4D:在感染之后在32°C下不同时间点的罗斯河病毒感染的NaBr曲线图。 图5A-5D:在感染之后在35°C/32°C下不同时间点的罗斯河病毒感染的NaBr曲线 图。 图6:在37°C和35°C/32°C下感染的罗斯河病毒接种物的Westernblot。 图7A-7D:在感染之后在35°C下不同时间点的西尼罗河病毒感染的NaBr曲线图， 同时附有显微图像。 图8A-8D:在感染之后在32°C下不同时间点的西尼罗河病毒感染的NaBr曲线图， 同时附有显微图像。 图9A-9D:在感染之后在35°C/32°C下不同时间点的西尼罗河病毒感染的NaBr曲 线图，同时附有显微图像。【具体实施方式】 本专利技术的一个方面是实现允许独立优化和控制下述条件的在此描述的两阶段温 度分布：（1)用于寄主细胞多周期感染的活性病毒的形成；（2)在后续的复制阶段中获得高 滴度的维持；以及（3)在后续的生产工艺阶段中的抗原形成。 在本专利技术的一种优选实施方式中，所述病毒是正粘病毒、a-病毒或黄病毒。 优选病毒是流感病毒，并且在特定的实施方式中，优选选自下组：甲型流感和乙 型流感、罗斯河病毒和西尼罗河病毒。虽然在此提供的实施例显示了通过使用本专利技术的 两温度方法进行改进的针对这些病毒的抗原的生产，但本专利技术预期的其他病毒的非限制 性例子包括：选自于由RNA病毒家族所构成的组的病毒，比如呼肠孤病毒（Reoviridae)、 小RNA病毒（Picornaviridae)、环状病毒（Caliciviridae)、披膜病毒（Togaviridae)、 沙粒病毒（Arenaviridae)、反转录病毒（Retroviridae)、黄病毒（Flaviviridae)、正粘病 毒（Orthomyxoviridae)、副粘病毒（Paramyxoviridae)、本雅病毒（Bunyaviridae)、弹状 病毒（Rhabdoviridae)、纤丝病毒（Filoviridae)、冠状病毒（Coronaviridae)、星形病毒 (Astroviridae)、或波纳病毒（Bornaviridae);以及选自于由DNA病毒家族所构成的组， 比如腺病毒（Adenoviridae)、乳多空病毒（Papovaviridae)、细小病毒（Parvoviridae)、 疱疼病毒（Herpesviridae)、痕病毒或肝DNA病毒（Hepadnaviridae)。在特定的实施方式 中，病毒选自下组：甲型流感/Panama(巴拿马）/2007/99、甲型流感/NewCaledonia(新 喀里多尼亚）/20/99、乙型流感/Shangdong(商东）/7/97、乙型流感/Malaysia(马来 西亚）/2506/2004、甲型流感/Hiroshima(广岛）/52/2005、以及甲型流感/Solomon Islands(所罗门群岛）/3/2006。 能够在任何适合病毒产生的细胞中制备出病毒。优选细胞是动物细胞培养物或细 胞系。这样的细胞可以来自特定的组织或胚细胞。动物优选是哺乳动物或鸟。本专利技术的各 种【具体实施方式】可以利用犬科细胞系、啮齿动物细胞系、鸟类细胞系或灵长类动物组织细 胞系。例如，在特定的实施方式中，细胞可以是MDCK细胞、CH0细胞、perC6细胞、HEK293细 胞、或其他的通常在病毒增殖中使用的细胞。在一些特定的实施方式中，细胞是上皮细胞， 尤其优选肾上皮细胞，比如非洲绿猴的Vero细胞。 在本专利技术特定的实施方式中，在不包含动物血清蛋白的培养基中培养细胞。这样 的培养基不包括，例如，牛血清或其部分，比如胎牛血清。这样的培养基被称为"无血清蛋白 培养基"。在病毒增殖期间，可以将病毒增殖所必需的蛋白酶比如胰蛋白酶加至培养基。在 一些实施方式中，这样的蛋白酶可以由非动物来源衍生得到，比如来自细菌或重组体来源； 或者可以由动物来源衍生得到。在在此使用的术语的意义内，这样的补加培养基仍然被认 为是无血清蛋白培养基。 在本专利技术优选的实施方式中，本专利技术的方法以工业规模进行。在本专利技术的一些实 施方式中，该方法在如下规模的细胞培养基中进行：大于50升的细胞培养基、50至100升 的细胞培养基、100至500升的细胞培养基、500至1000升的细胞培养基、或者大于1000升 的细胞培养基（例如，在6000升、10, 000升、甚至更大的生物反应器中进行）。在本专利技术的 一些实施方式中，本专利技术的方法在搅拌罐式生物反应器中进行。 在本专利技术优选的方法中，第一病毒增殖温度低于用于给定的寄主细胞类型的细胞 培养增殖温度。在一些实施方式中，当前第1页1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产病毒的方法，该方法包括：提供已经被病毒感染的寄主细胞；在31℃至37℃的第一温度下培养感染的寄主细胞1至48小时，其中所述第一温度低于用于病毒感染前的寄主细胞的增殖温度；随后在比所述第一温度低1℃至6℃的第二温度下培养感染的寄主细胞；以及收集上述培养步骤中所产生的病毒拷贝。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：曼弗雷德·赖特，利奥波德·格里伯格，沃尔夫冈·蒙特，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US