本发明专利技术涉及一种检测莲草直胸跳甲肌动蛋白（actin）基因转录水平的试剂盒，该发明专利技术属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增技术领域。本发明专利技术首先保护了一种检测引物，序列如SEQ. ID NO.1和SEQ. ID NO.2所示，其次提供了一种操作简便、快速，且能够定量检测莲草直胸跳甲actin基因转录水平的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒由SYBR Premix Ex Taq、引物混合物、标准actin基因模板和超纯水组成。本发明专利技术还保护了该试剂盒用于检测莲草直胸跳甲actin基因的表达量的用途。本发明专利技术可以准确的测定actin基因的转录水平，并具有高度的特异性，扩增曲线结果表明actin基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线，熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测莲草直胸跳甲肌动蛋白（actin)基因转录水平的试剂盒，该 专利技术属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增
技术介绍
聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR)，即DNA体外扩增技术，是 1985年由美国Mullis首创的一种生物高技术，随着耐高温的Taq酶的出现，扩增自动化的 完善，PCR近年得以迅速推广，它仅需要微微克水平的模板就能快速特异大量地复制任何所 希望的基因或DNA片断。 荧光定量PCR是一种核酸定量技术，该技术在PCR反应系统中引入了特定的荧光 标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的 扩增情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，从而获得每个反应管的Ct值(荧光变化 达到阈值时的循环数)，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据 此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。SYBRGreen是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。利用荧光染料（SYBR Green)与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加。在PCR反应体系中，加入 过量SYBRGreenI荧光染料，当该染料掺入DNA双链后，荧光信号增强；当DNA变性时SYBR GreenI染料释放出来，荧光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物， SYBRGreenI染料与双链产物结合，经检测获得荧光的净增量。荧光信号的增加与PCR产 物的增加完全同步。这种高灵敏度、较低毒性的核酸染料在结合双链DNA分子后荧光增强 800-1000 倍。SYBRGreen在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结 合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于 一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBRGreen的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green与所有的双链DNA结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起 的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物 的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreen得到定量结果的准确 性。 在荧光定量PCR检测基因表达水平时，经常检测某个基因的相对表达量，其中内 参基因常常选择actin。|3-actin即|3肌动蛋白，是actin家族的一员，在维持细胞结 构，细胞内运动，细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。0-actin基因是应用 较为广泛的管家基因之一。管家基因（house-keepinggenes)是指所有细胞中均要表达的 一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。在进行定量PCR时，可以通过计 算目的基因和管家基因的比值，得到基因表达的相对浓度。通过大量的实验研宄，我们优化 出了一套能够有效检测莲草直胸跳甲actin基因表达量的引物和PCR反应体系，并组装成 actin基因表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学、植物保护研宄者的 检测需要。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种操作简便、快速，且能够定量检测莲草直胸跳甲actin 基因转录水平的荧光定量PCR检测试剂盒。 本专利技术的技术方案如下： 本专利技术首先提供了一种莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测引 物混合物，所述引物混合物由引物1 : 5 ' -AAGCCCAAAGCAAAAGAGGTAT-3 '和引物2 : 5 ' -TGTAGAAGGTGTGATGCCAGAT-3 '组成。 其次，本专利技术提供了一种利用所述引物混合物的莲草直胸跳甲actin基因转录水 平焚光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒由SYBRPremixExTaq、引物混合物、标准actin基 因模板和超纯水组成。 所述引物混合物中：引物1为10Mmol/L、引物2为10Mmol/L。 所述标准actin基因模板：浓度为1. 0Mmol/L，标准actin基因模板序列为： 5'-AAGCCCAAAGCAAAAGAGGTATCCTCACCTTGAAATACCCAATTGAACACGGTATCATCACCAACTGGGATGA TATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTCTACA-3 '。 超纯水组成：纯度超过18. 25MQ?CM。 本专利技术还保护了所述的莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂 盒的用途，将该试剂盒用于检测莲草直胸跳甲actin基因的表达量。 所述检测包括建立PCR反应体系：总体积为25ML，SYBRPremixExTaq12. 5 ML、模板cDNA或标准actin基因模板1. 5ML、引物混合物1. 0ML、超纯水10mL。 本专利技术可以准确的测定actin的表达水平，并具有高度的特异性，扩增曲线结果 表明actin基因荧光信号值符合标准的"S"型曲线（图1)，熔解曲线表明该荧光定量具有高 度的检测专一性（图2)。【附图说明】 图1:莲草直胸跳甲actin基因扩增曲线； 图2 :莲草直胸跳甲actin基因熔解曲线。【具体实施方式】 以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。 本试剂盒由SYBR?PremixExTaq? (购自Takara公司）、引物混合物、标准actin 基因模板和超纯水组成，试剂盒组成： 表1试剂盒中各组成成分如下： SYBR?PremixExTaq?:内含TaKaRaExTaq?HS，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，SYBR?GreenI等。 引物混合物：引物1为10Mmol/L、引物2为10Mmol/L， 引物 1 序列为 5 ' -AAGCCCAAAGCAAAAGAGGTAT-3 '、 引物 2 序列为 5 ' -TGTAGAAGGTGTGATGCCAGAT-3 '; 标准actin基因模板：浓度为1. 0Mmol/L，actin基因模板序列为：5 ^-AAGCCCAAAGCA AMGAGGTATCCTCACCTTGAAATACCCAATTGAACACGGTATCATCACCMCTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGC ATCACACCTTCTACA-3 '； 超纯水组成：纯度超过18. 25MQ?CM。 混合适当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种莲草直胸跳甲actin基因转录水平荧光定量PCR检测引物混合物，其特征在于：所述引物混合物由引物1：5＇‑AAGCCCAAAGCAAAAGAGGTAT‑3＇和引物2：5＇‑TGTAGAAGGTGTGATGCCAGAT‑3＇组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑丽祯，傅建炜，史梦竹，李建宇，游泳，林涛，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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