一种培养微藻生产氢气的方法技术

本发明专利技术提供了一种培养微藻生产氢气的方法，首先构建微藻的聚集体，然后将微藻的聚集体重悬于培养基中，在光照条件下培养，生产氢气。构建微藻的聚集体方法包括以下步骤：(1)将微藻细胞培养至对数生长期，且细胞密度不小于1.2×108cells/mL；(2)将带氨基的阳离子聚电解质以0.5g/L～2g/L的量加入微藻细胞溶液中进行表面改性；(3)收集微藻细胞，与2～10mM硅酸溶液混合，搅拌至微藻的聚集体形成。应用此方法实现了微藻在自然有氧条件下的可持续光产氢，克服微藻产氢持续时间短、效率低等问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程与
，具体涉及。
技术介绍
氢气长久以来一直被人们认为是一种理想的有前途的石化能源替代物，因为它 燃烧产物是水，对环境友好，并且能量效率高。当前，氢气的工业制备主要是来源于烃类 化合物的蒸汽裂解和水的电解，但是这些氢气的制备方式是能源成本很高并且不可持续。 氢气的绿色生产一直是一个挑战。光生物产氢被认为是一种理想的可持续的产氢途径。 在自然界中，光合微生物，尤其是绿藻可以利用光合系统和氢酶将水光解为氢气和氧气 (A.Hemschemeier,T.Happe.Alternativephotosyntheticelectrontransportpathways duringanaerobiosisinthegreenalgaChlamydomonasreinhardtii.Biochim. Biophys.Acta, 2011，1807:919 - 926)。但是，这是一个短暂的过程，只发生在黑暗-光照 交替的几分钟之内。因为与产氢密切相关的氢酶在氧气的氛围下会丧失催化功能。在黑 暗的条件下，细胞呼吸创造厌氧环境激活氢酶，在黑暗进入光照的短暂时间内，光合系统 II(PSII)产生的光合电子可以传递到氢酶上与氢质子结合生成氢气。但是光合作用产生的 氧气又会使氢酶失活。因此，持续时间短和效率低限制了绿藻产氢的应用。 为了改进和提高绿藻的生产氢气能力，筛选和寻找有耐氧氢酶的绿藻突变株，以 及通过蛋白质工程和基因改造降低氢酶对氧气的敏感性，是目前看来最有前景的两条途 径。但是目前发现的有耐氧氢酶的绿藻是极少的，并且还没有发现能够在光下可持续产氢 的，而通过蛋白质工程和基因改造的办法前提是要解析氢酶的晶体结构，这本身就是一项 极具挑战性的工作，目前进展也是很缓慢。有人尝试把某种光合细菌对应的氢酶基因导入 到绿藻中，但效果并不明显。目前，在绿藻光产氢研宄领域最普遍的手段是通过缺硫培养的 方法，为绿藻细胞制造缺氧环境，诱导氢酶表达，实现生产氢气。但是这样一种代谢处理会 抑制光合系统II的活性，并终止生产氢气（T.K.Antal,etal.Thedependenceofalgal H2productiononPhotosystemIIand02consumptionactivitiesinsulfur-deprived Chlamydomonasreinhardtiicells?Biochim.Biophys.Acta, 2003, 1607:153 - 160)〇 迄今为止，还没有实现绿藻在自然有氧条件下的可持续光产氢。
技术实现思路
本专利技术提供了，实现微藻在自然有氧条件下的可持 续光产氢，克服微藻产氢持续时间短、效率低等问题。 为解决上述的技术问题，本专利技术提供了，包括以下 步骤： (1)构建微藻的聚集体； (2)将微藻的聚集体重悬于培养基中，在光照条件下培养，生产氢气。 微藻细胞形成一定尺寸的聚集体之后，由于微环境的改变，在空间上将出现功能 的分化。在聚集体外层的细胞，依然可以进行光合作用放出氧气，而在聚集体内层的细胞， 由于外层细胞阻挡了部分光照，使得内层细胞光合作用减弱，越在内层光合作用越弱，但是 细胞的呼吸作用却不会因为光照的改变而有太多变化，因而当聚集体的尺寸达到一定大小 时，在聚集体的内层细胞会达到呼吸耗氧和光合放氧的动态平衡，这时便可维持聚集体内 层的厌氧环境，在厌氧环境中氢酶可以表达，并能保持活性，在有光合电子同时存在的条件 下，即可催化2H++2f-H2反应的进行生成氢气（图1)。 优选的方案，所述的微藻为绿藻。在自然界中，光合微生物，尤其是绿藻可以利 用光合系统和氢酶将水光解为氢气和氧气。目前研宄较多的单细胞绿藻主要有纤维藻 (Ankistrodesmussp.)、莱茵衣藻（Chlamydomonassp.)、小球藻（Chlorellasp.)、栅藻 (Scenedesmussp.)和月牙藻（Selenastrumdibraianum)等。 更为优选的方案，微藻为蛋白核小球藻。在自然条件下，小球藻是单细胞分散的， 直径大约在3~4微米。目前蛋白核小球藻已经商业化，在实际应用中更容易获得。 所述的微藻的聚集体的直径为50~150ym。当聚集体的尺寸达到一定大小时， 维持聚集体内层的厌氧环境，氢酶得以表达，并能保持活性，在有光合电子同时存在的条件 下，产生氢气。 所述的培养基包括但不限于TAP培养基、SE培养基或BG11培养基等，本专利技术优选 TAP培养基。TAP培养基提供蛋白核小球藻正常生长所需，在此培养条件下，蛋白核小球藻 可维持正常的生长周期。 所述的光照条件为100yE?nT2 ? ~200yE?nT2 ? 的光照强度。 构建微藻聚集体的方法包括以下步骤： (1)将微藻细胞培养至对数生长期，且细胞密度不小于1. 2X108cells/mL; (2)将带氨基的阳离子聚电解质以0. 5g/L~2g/L的量加入微藻细胞溶液中进行 表面改性； (3)收集微藻细胞，与2~10mM硅酸溶液混合，搅拌至微藻的聚集体形成。 培养至对数生长期得到性状稳定统一的微藻细胞，且微藻溶液中的微藻细胞要达 到一定的数量才有利于下一步聚集体的形成。 由于微藻个体微小，且细胞表面多带负电荷，因而其个体在培养液中可以均匀地 分散悬浮，形成稳定的分散体系。通过向微藻溶液中加入带有氨基阳离子聚电解质，使微藻 细胞表面带有电荷和诱导硅酸矿化的活性位点。 硅酸溶液在氨基的催化作用下会发生聚合反应生成二氧化硅，聚硅酸是用中和法 即由硅酸钠在加酸条件下水解、聚合反应到一定程度的中间产物。聚硅酸带负电荷，属阴离 子型无机高分子物质，通过吸附架桥使微藻聚集。 优选的方案，步骤（2)中，所述的阳离子聚电解质为聚二甲基二烯丙基氯化铵，以 lg/L的量加入微藻细胞溶液中。此浓度既能保证有足够多的阳离子聚电解质吸附到微藻细 胞表面，又不会因浓度太高对微藻细胞产生生物毒性。 优选的方案，步骤（3)中，所述的硅酸溶液浓度为5mM。既能保证有足够二氧化硅 形成使细胞聚集，又不至于发生均相的自聚。 优选的方案，步骤（3)中，所述的聚集时间为0. 5~lh。 本专利技术达到的有益效果：通过本专利技术的技术方案用带氨基的阳离子聚电解质对 微藻细胞表面改性，在硅酸溶液中聚集形成一定大小尺寸的微藻的聚集体，使得聚集体的 内层细胞达到呼吸耗氧和光合放氧的动态平衡，在微藻培养体系中直接利用可见光生产氢 气，制备工艺简单，产氢效率提高，有潜在应用价值。【附图说明】 图1为小球藻聚集产氢示意图； 图2为自然状态的蛋白核小球藻与聚集的蛋白核小球藻对比图； 其中，（a)为自然状态的蛋白核小球藻的光学显微镜照片和扫描电镜照片， (b)为小球藻聚集体的光学显微镜照片和扫描电镜照片， (c)为自然状态的小球藻培养液加入三氧化钨粉末（试管底部）在 100yE?nT2 ? ^光照下照射12小时后的照片， (d)为自然状态的小球藻和聚集的小球藻培养液都加入三氧化钨粉末的照片， (e)为聚集的小球藻培养液都加入三氧化钨粉（试管底部）在100 yEi1光 照下照射12小时后的照片；图3为自然状态的小球藻和聚集的小球藻在有氧条件下的生产氢气对比图。【具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建微藻的聚集体；(2)将微藻的聚集体重悬于培养基中，在光照条件下培养，生产氢气。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：熊威，赵小红，马为民，徐旭荣，唐睿康，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33