本发明专利技术提供了lncRNA-MALAT1在制备增生性玻璃体视网膜病变(PVR)诊断试剂中的应用。本发明专利技术还提供了一种PVR诊断的MALAT1检测试剂盒。该试剂盒包括RNA抽提体系、反转录反应体系和PCR反应体系。本发明专利技术的试剂盒利用实时荧光定量PCR方法，通过检测血清或者血浆中MALAT1的相对含量，进行PVR的早期诊断。该方法具有创伤性小，操作方便等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学生物检测
，具体涉及lncRNA-MALATl在制备增生性玻璃 体视网膜病变诊断试剂中的应用以及一种辅助PVR疾病早期诊断的MALAT1试剂盒，及其在 辅助PVR的早期诊断中的应用和检测方法。
技术介绍
增生性玻璃体视网膜病变（PVR)常见于过强的冷凝、电凝、外伤后、巨大视网膜裂 孔、多发视网膜裂孔、长期孔源性视网膜脱离、多次眼内手术、眼外伤以及眼内炎症等，其潜 在的危险因素尚不十分肯定，发病机制十分复杂。因此，PVR疾病的早期诊断仍然是眼科学 家面临的最严峻挑战之一，然而迄今为止，并没有特异性强用于PVR疾病辅助诊断的生物 学指标。PVR目前的治疗主要是采用玻璃体手术治疗。手术中应用膜剥除、视网膜切开或切 除、眼内光凝等使视网膜复位，然后用长效气体或硅油充填。虽然在大多数病例，手术中通 常可以使视网膜复位，但术后眼内细胞增生复发，仍是手术失败的主要原因。在体外或动物 实验的药物包括糖皮质激素和抗代谢药，以及放射疗法等，显示了不同程度的效果。然而在 临床应用过程仍然是收效甚微。因此，亟需寻找PVR发生的生物标记物，对PVR发生和患者 的预后判断进行科学地判断。 长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编 码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调 控基因的表达水平。在许多人类疾病发生过程，包括肿瘤、心血管、神经系统和血液疾病等 发生过程发生异常表达。最近研宄表明，部分lncRNA可以形成稳定的二级结构，稳定地存 在于血清/血浆中，使其免受血液中大量存在的RNase的降解，表现出高度地稳定性。肺腺癌转移相关转录子 1 (metastasis-associatedlungadenocarcinoma transcript1，MALAT1，NCBIReferenceSequence:NR_002819. 2)属于LncRNA家族成员， 编码基因定位于染色体llql3. 1，普遍表达于人类和鼠的组织细胞中，尤以神经系统突出。 MALAT1 最早于 2003 年由Ji等（JiP，DiederichsS，WangW，etal.MALAT-l，anovel noncodingRNA,andthymosinbeta4predictmetastasisandsurvivalinearly-stage non-smallcelllungcancer.Oncogene, 2003, 22:8031-41)在观察早期非小细胞肺癌 (non-smallcelllungcancer,NSCLC)的转移现象时被发现，并因此得名。后诸多研宄显 示，MALAT1与乳腺、胰腺、肺、结肠、前列腺和肝脏等组织恶性肿瘤均显著相关。 目前，尚无lncRNA-MALATl作为增生性玻璃体视网膜病变早期诊断的生物学标记 物的报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供了lncRNA-MALATl的新的用途，可作为诊断试剂用于增生性 玻璃体视网膜病变的诊断，特别是增生性玻璃体视网膜病变的早期诊断。 本专利技术具体技术方案如下： 核苷酸序列如SEQIDN0:1所示的IncRNA-MALAT1在制备增生性玻璃体视网膜病变 诊断试剂中的应用。 本专利技术的另一个目的在于提供一种增生性玻璃体视网膜病变诊断的Inc RNA-MALAT1检测试剂盒，包括RNA抽提体系、RNA反转录反应体系和PCR反应体系，其中PCR 反应体系含有特异性扩增如权利要求1所述SEQIDN0:1基因序列的引物序列。进一步的， 所述引物序列为MALAT1特异性的qRT-PCR的上下游引物。 上述检测试剂盒，所述RNA抽提体系包括RNA抽提试剂；RNA逆转录反应体系包 括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；PCR反应体系包括扩增系统和引物系统， 所述扩增系统为SYBRPremixExTaq?试剂；所述引物系统包括RNA反转录随机引物和 MALAT1特异性的qRT-PCR的引物，其中， 上述RNA反转录随机引物可以选择GAPDH和/或Beta-tubulin的定量PCR引物序列。GAPDH定量PCR引物序列，上游引物序列如SEQIDN0:2所示，下游引物序列如SEQ IDN0:3 所示； Beta-tubulin定量PCR引物序列，上游引物序列如SEQIDN0:6所示，下游引物序列如SEQIDN0:7 所示； MALAT1特异性的qRT-PCR的上游引物如SEQIDN0:4所示，下游引物如SEQIDN0:5 所示。 上述检测试剂盒，包括： (a) 抽提体系： 1) Trizolreagent，1 管，2000yL/ 管； 2) 氯仿，1管，500yL/管； 3) 无水乙醇，1管，8000yL/管； 4)DEPCddH20,1 管，1000yL/ 管； 5)ddH20,1 管，2000yL/ 管； 6) 异丙醇，8000yL/管； (b) 反转录体系： 1) 总RNA反转录引物（包括OligodT和Random6mers)，1 管，浓度：50yM，50yL/管； 2) 反转录酶（200U/yL) 50yL; 3)dNTPMixture(10mMeach)50yL； 4) 反转录buffer50yL; (c) PCR体系： 1) SYBRPremixExTaq酶； 2)buffer100yL； 3)MALAT1特异性的qRT-PCR上游引物，1管，10yM，100yL/管； MALAT1特异性的qRT-PCR下游引物，1管，10yM，100yL/管； GAPDH定量PCR上游引物，1管，10yM，100yL/管； GAPDH定量PCR下游引物，1管，10yM，100yL/管； 和 / 或，Beta-tubulin定量PCR上游引物，1 管，10yM，100yL/管； Beta-tubulin定量PCR下游引物，1 管，10yM，100yL/管； 4)dNTPMixture(10mMeach)50tiL〇 本专利技术采用Agilent公司IncRNAmicroarray筛选出PVR疾病的视网膜增殖膜 和其他眼科疾病的视网膜增殖膜的差异表达谱，并联合应用定量PCR方法验证芯片分析结 果。最后，选用IncRNA分子MALAT1作为生物标记物，用于辅助PVR疾病的早期诊断。 本专利技术中确定lncRNA-MALATl作为PVR疾病早期诊断的生物标记物包括如下步 骤： 第一步：样本准备：眼科玻璃体手术后的视网膜前膜标本（实验组，n = 30)和白内障 增殖膜标本（对照组，n= 30)，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80°C备 用。 第二步：差异表达IncRNA筛选：采用美国Aglient公司的IncRNA表达谱芯片，分 析PVR疾病发生相关的IncRNA;分析具体步骤为：采用标记酶将荧光基团标记IncRNA，得 到用于与芯片杂交的荧光探针，在标注条件下使用MAUI杂交仪和芯片杂交；使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数值型数据进行保存；采用 GenespringGX软件分析找出PVR发生相关的IncRNA分本文档来自技高网...
【技术保护点】
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的lnc RNA‑MALAT1在制备增生性玻璃体视网膜病变诊断试剂中的应用。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：颜标，蒋沁，姚进，周荣妹，
申请(专利权)人：南京医科大学眼科医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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